Drosophila Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как препарировать имагинальные диски и мозг глаз-антенн дрозофилы, несущих генетически определенные флуоресцентно помеченные клоны, и как их обрабатывать для визуализации и количественной оценки изменений экспрессии генов и инвазивности клеток. Описанные процедуры могут помочь получить новое представление о роли генов и развитии эпителия, гомеостазе или заболеваниях, а также проанализировать механизмы, лежащие в основе их конкуренции, компенсаторной пролиферации или интерклональной корпорации. Основное преимущество исследования заключается в том, что мы предоставляем полный набор протоколов, предназначенных для глубокого количественного и качественного анализа генетической мозаики дрозофилы.

Как правило, люди, впервые работающие с моделью дрозофилы, испытывают трудности, потому что они не могут отличить имагинальный диск глаз-антенна от другого имагинального диска. Для облегчения распознавания глазно-усикового имагинального диска, несущего в теле личинки флуоресцентно маркированные клоны, рекомендуется проводить первичные вскрытия под флуоресцентным микроскопом. Мозаичный анализ с помощью репрессируемого клеточного маркера или MARCM позволяет генерировать генетически определенные клональные участки в фенотипически диком контексте.

FLP, приводимый в действие промотором без глаза, катализирует рекомбинацию между двумя элементами FRT, фланкирующими стоп-кассету, помеченную желтым геном. После репликации ДНК FLP катализирует обмен несестринских хроматид между гомологичными хромосомами, образующими сестринские хроматиды. Один из них несет аллель дикого типа и репрессор Gal80, а другой — мутантный.

При митозе они разделяются, образуя две дочерние клетки, одна из которых является гомозиготным мутантом, а другая — диким типом. Потеря репрессора Gal80 позволяет экспрессировать GFP у мутанта, в то время как клетки дикого типа остаются GFP-отрицательными. Чтобы начать эксперимент, соберите мозаичных личинок, впрыснув PBS в бутылку для мух, чтобы покрыть поверхность пищи.

Затем размягчите верхний слой с помощью шпателя и вылейте пищевую кашицу, содержащую личинок, в чашку Петри. Аккуратно соберите личинок и переложите их в чашку для эмбрионов, наполненную PBS. Соберите не менее 20 личинок для иммуноокрашивания и 80 личинок для количественной оценки инвазивности опухолей.

Промойте личинок PBS, чтобы удалить все остатки пищи. С помощью флуоресцентного стереомикроскопа с увеличением 8:16x определите и отбросьте всех личинок леопарда, которые демонстрируют случайные положительные пятна GFP по всему телу. Поставьте чашку, содержащую оставшиеся в PBS личинки, на лед до вскрытия.

Чтобы препарировать глазно-антенный имагинальный диск под стереомикроскопом, используйте одну пару щипцов и аккуратно захватите личинку примерно на 2/3 длины тела позади головы. Второй парой щипцов захватите личинки за ротовые крючки и оттяните их от тела. С помощью щипцов отсоединяют крючки рта от перекрывающейся кутикулы и посторонних тканей, таких как слюнные железы и жировое тело.

Как вариант, чтобы приготовить комплекс глаз-антенный диск мозга, сохранив вентральный нервный канатик в целости и сохранности, с помощью щипцов разрезают личинку в середине тела. Откажитесь от задней половины. Придерживайте переднюю половину тела личинки кончиками одной пары щипцов, затем переверните личинку наизнанку, проталкивая кончиком второй пары крючки внутрь и перекатывая по ней кутикулу первой парой щипцов.

Осторожно удалите все посторонние ткани, включая кишечник, жировое тело и слюнные железы. Аккуратно оттяните крючки для рта в сторону от кутикулы. Освободите комплекс глаз-антенный диск мозга, прикрепленный к ротовым крючкам, перерезав аксональные выступы, идущие от вентрального нервного канатика к мышцам и эпидермису.

Чтобы перенести ткань, сначала покройте наконечник микропипетки P20, пипетируя оставшиеся тушки тела вверх и вниз несколько раз, а затем используйте тот же наконечник для переноса рассеченной ткани. Для переноса более крупных комплексов глаз-усиковый диск мозга предварительно вырезают кончик Р20 для увеличения отверстия. Зафиксируйте образцы в 400 микролитрах фиксатора 4% PFA в течение 25 минут при комнатной температуре во время натирания.

Затем снимите фиксатор и промойте образцы ПБСТ трижды в течение 10 минут с нутацией. Далее замените PBST на 500 микролитров раствора для окрашивания DAPI и потушите в течение 15 минут в темноте. Промойте салфетку один раз в течение 10 минут с помощью PBST.

Чтобы завершить рассечение, используйте пипетку объемом в один миллилитр, чтобы перенести ткань обратно в стеклянную чашку, наполненную PBS. С помощью двух пар щипцов отделите мозг, который будет использоваться для количественной оценки инвазивности, от глазных антенных дисков путем разрезания зрительных стеблей. Освободите диски глаз и усиков, отрезав их от крючков для рта.

Поместите каплю монтажного средства на отводящее предметное стекло и с помощью щипцов распределите жидкость тонким слоем. Чтобы количественно оценить инвазивность, поместите на один слайд не менее 80 неповрежденных мозгов для каждого генотипа. Выпрямите и расположите ткань по желанию.

Осторожно коснитесь одного края покровного стекла к среде и медленно опустите его с помощью щипцов, чтобы избежать образования пузырей. Используйте лабораторную салфетку, чтобы впитать излишки монтажного материала по краям. Теперь ткань можно исследовать с помощью конфокальной визуализации.

Попросите нейтральную сторону анонимизировать слайды, чтобы оценка была непредвзятой. И получить независимую оценку слайдов как минимум двумя исследователями. Раскрывайте генотипы только после завершения скоринга.

Оцените степень злокачественности под флуоресцентным стереомикроскопом, оснащенным набором фильтров GFP. Использование маркера для обозначения мозгов, которые уже были просмотрены, позволяет избежать двойного счета. Флуоресцентные конфокальные изображения показывают мозг, препарированный из личинок, несущих злокачественные RAS V12 мутантные клональные опухоли, меченные GFP, окрашенные DAPI.

Панели представляют четыре различные степени инвазивности опухолей. Непредвзятая количественная оценка показала, что ингибирование передачи сигналов JNK и RAS V12 подавляет инвазивность опухоли одним клоном. В контрольных дисках глаз и усиков чувствительный к JNK репортер TRE-DsRED помечает только узкую полоску клеток, идущую от усика к глазной части.

Напротив, активность TRE-DsRED была заметно повышена в GFP-положительных злокачественных клональных опухолях. К 8-му дню опухолевые клетки разрастались между ушными дисками глаза и распространялись на вентральный нервный канатик. Вторгшиеся опухолевые клетки также показали повышенную активацию JNK по сравнению с окружающими тканями.

В то время как блокирование JNK явно снижало активность TRE-DsRED в опухолевых клонах, увеличение интенсивности лазера выявляло усиление эпителиальных клеток, соседних с клонами. Кроме того, репортер DsRED показал, что в отличие от нескольких кластеров гемоцитов, обнаруженных в углублениях контрольного эпителия глаза, гемоциты глазного антенного эпителия накапливаются в глазной антеннальной и мозговой ткани, состоящей из злокачественных опухолей. При ингибировании JNK количество ассоциированных иммунных клеток резко уменьшалось.

Повышенная инвазивность опухоли, активность JNK и инфильтрация гемоцитов сопровождались значительным повышением регуляции мНРА MMP1, что было определено по QRTPCR с использованием общей РНК, выделенной из рассеченных мозаичных дисков глаза-антенны. После освоения более 60 пар глазных дисков и мозг могут быть препарированы в течение 30 минут. При проведении этой процедуры важно помнить о том, что нужно получить достаточное количество личинок желаемых генотипов.

Будьте быстры, но точны при препарировании, чтобы исключить образцы, предназначенные для выделения РНК. После процедуры диссекции вестерн-блот может быть использован в качестве альтернативы иммуноокрашиванию для оценки изменений экспрессии белков между различными генотипами. Создание генетической мозаики и ее анализ с помощью описанных процедур позволяет исследовать потенциально смертельные мутации и механизмы корпорации онкогенов, и после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как препарировать мозаичные ткани диска глаза-антенны и мозга личинок третьего возраста и как обрабатывать их для иммуноокрашивания, визуализации трансгенной и портовой активности. Экстракция РНК и количественная оценка инвазивности.

Напоминаем, что PFA, а также фенол-хлороформ и DAPI очень токсичны, и что при работе с этими агентами всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных перчаток и одежды.