Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании различных вирусологических и биохимических подходов для анализа роли сигнального пути хозяина в литической репликации модельного вируса герпеса. В качестве примера мы исследуем роль митохондриального противовирусного сигнального белка Mavs при инфицировании вирусом герпеса гамма HV 68. Первыми, кто изучил роль Mavs во время острой инфекции, мыши дикого типа и мышей с нокаутом Mavs заражаются гамма HV 68 после острой вирусной инфекции.

Легкие мыши собирают и определяют вирусную нагрузку с помощью анализа бляшек, при котором образцы последовательно разбавляют и помещают в пластины. На монослоях затем подсчитывается количество бляшек. Повышенная вирусная нагрузка у мышей с нокаутом позволяет предположить, что интересующий ген играет противовирусную роль.

Напротив, снижение вирусной нагрузки у нокаутных мышей указывает на то, что ген необходим для вирусной инфекции. Кинетика вирусного многоступенчатого роста in vitro исследуется в эмбриональных фибробластах мыши, дикого типа и нокаутирующих мышиных эмбриональных фибробластах мыши, инфицированных гамма-HV 68 и инкубированных в течение различного времени. Затем клетки собирают и проводят анализ бляшек для сравнения многоступенчатой кинетики роста между клетками дикого типа и клетками с дефицитом mavs.

Для дальнейшей проверки этих результатов эмбриональные клетки фибробластов мышей дикого типа и mavs с нокаутом инфицированы гамма HV 68. Затем ДНК и РНК отдельно извлекаются из инфицированных клеток, а вирусные геномные транскрипты анализируются с помощью ПЦР в реальном времени. Впервые идея этого протокола пришла нам в голову, когда мы изучали роль иммунного пути хозяина во время вирусной инфекции.

Этот протокол потенциально может быть применен для исследования правил передачи сигналов хозяина во время инфекции другими патогенами. Начните эту процедуру, позволив мышам возрастом от шести до восьми недель адаптироваться в течение четырех дней после отправки. Следующий эксперимент будет проведен на объекте биологической опасности.

При подготовке наденьте средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки, маску и ботинки, работающие в шкафу биобезопасности. Уровень второй. Приготовьте вирусную суспензию с 40 до 10 000 БОЕ гамма HV 68 и 30 микролитрами стерильных ПБС для каждой мыши, которая будет инфицирована.

Держите вирусную суспензию на льду после внутрибрюшинной инъекции кетамина ксилазина. Убедитесь, что мыши были усыплены, выполнив щипывание пальцев ног. Затем с помощью пипетки введите 30 микролитров вирусной суспензии по каплям в левую или правую ноздрю.

Положите мышь на бок на пять-10 минут, чтобы облегчить доставку вируса через дыхательные пути в легкие. Затем поместите мышей обратно в клетку и наблюдайте за ними, пока они полностью не оправятся от седации. Затем у инъекционных мышей собирают легочную ткань для приготовления клеточного лизата для оценки титра вируса в различные дни после заражения.

Поместите легкие, собранные у умеренных мышей, в стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 миллилитров, содержащие 500 микролитров 1,0-миллиметровых шариков диоксида циркония на льду. Если нет, переходите к следующему шагу в тот же день. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия.

В противном случае добавьте один миллилитр холодной сыворотки без DMEM. Поместите трубку в венчик для бусин и нажмите кнопку «Старт» для гомогенизации легких в течение 30 секунд. Во избежание перегрева образца, что может инактивировать вирус.

Охладите пробирку на льду не менее одной минуты после 30 секунд гомогенизации. Затем повторите этот процесс. Затем центрифугируйте гомогенизированную ткань при 16 000 RCF при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты.

После вращения клеточный мусор будет находиться на дне трубки, а липиды — на поверхности. Немедленно примите снат, как показано здесь, чтобы выполнить анализ бляшки с использованием монослоя NIH 3, T, three или BHK 21. Затем проводится анализ бляшек Чтобы определить титр вируса, присутствующий в образце, начните анализ бляшки с последовательного разведения вирусной надосадочной жидкости.

Сначала с помощью многоканальной пипетки добавьте 270 микролитров среды в 96-луночный планшет. Оставьте первую строку пустой. Затем добавьте 200 микролитров надосадочной жидкости в первый ряд 96-луночной пластины планшета для каждого образца в трех экземплярах.

Далее переложите 30 микролитров образца из первого ряда в следующий ряд и перемешайте. Затем переложите 30 микролитров смеси в следующий ряд и перемешайте. Повторите этот шаг несколько раз, чтобы получить десятикратное серийное разведение.

Далее добавьте разведенный вирусный надосадочный слой на монослой клетки. В 24 луночной пластине. Поместите планшет в инкубатор и встряхивайте планшет каждые 30 минут в течение двухчасовой инкубации после инкубации для удаления клеточного мусора, аспирации надосадочной жидкости из планшета.

Затем промойте клетки один раз свежей средой. После промывки добавьте в клетки среду, содержащую метилцеллюлозу. Инкубируйте клетки в течение четырех-шести дней.

По прошествии четырех-шести дней. С помощью микроскопа считайте номер бляшки для каждого образца. Запишите количество бляшек для каждого разведения.

Затем рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение. Лунки, содержащие слишком много или слишком мало бляшек, не могут быть использованы для точного расчета титра. Так что для каждого образца используйте разведение, в котором имеется от семи до 70 бляшек.

Этот образец, разбавленный в 1000 раз, имеет в среднем 23 бляшки на лунку. Чтобы рассчитать титр вируса в неразбавленном растворе, умножьте коэффициент разведения на количество бляшек на количество микролитров в миллилитре. Затем разделите его на объем разведенного надосадочного вещества, добавленного на лунку.

Таким образом, в данном примере 1000 умножить на 23 бляшки умножить на 1000 микролитров на миллилитр разделить на 100 микролитров равно 2,3 умножить на 10 с точностью до пятой части образующих единиц на миллилитр. Затем для определения кинетики роста гамма-HV 68 в эмбриональных фибробластах мышей используют вирусный стоковый раствор с известным титром. На следующий день замените среду в каждой лунке на 0,5 миллилитра суспензии с низким MOI gamma HV 68.

Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и дайте инкубатору продолжаться в течение двух часов на протяжении всей инкубации. Раскачивайте тарелку каждые 30 минут после инкубации. С помощью пипетки удалите вирусную суспензию и добавьте 0,5 мл свежего полного СВ ЭМ, содержащего 8% фетальной бычьей сыворотки, в клетки, инфицированные вирусом.

Поместите клетки обратно в инкубатор через несколько дней после заражения. Соберите клетки среднего конца, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Переложите их в стерильные центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, немедленно заморозьте пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы высвободить гамму HV 68 из Mets.

Выполните три цикла заморозки и размораживания. Разморозьте ячейки, поместив их при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем сделайте вихрь и поместите их обратно в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Определите титр вируса с помощью анализа бляшек с использованием монослоя NIH three T 3 или BHK 21, как было показано ранее, чтобы выяснить, влияет ли на репликацию ДНК или РНК дефицит генов хозяина или вирусных генов. Начните с инфицированных клеток в разные дни после заражения, выбросьте надосадочную жидкость, промойте клетки холодным PBS и трипсиновым льдом. Затем гранулируйте клетки путем центрирования при температуре 1000 RCF при комнатной температуре в течение одной минуты после вращения, выбросьте надосадочную жидкость и храните клетки при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Извлечь общую ДНК и РНК, которая имеет хозяинское и вирусное происхождение. Затем центрифугируйте спиновые колонны. Выполняйте ПЦР в реальном времени с использованием общей ДНК и праймера, специфичного для вирусных литических транскриптов.

Определите относительное количество внутриклеточного гамма-генома HV 68 по отношению к гену хозяина, такому как бета-актин. Приготовьте КДНК с общей РНК и олиго-праймером DT. Проведите ПЦР в реальном времени с использованием CD NA и праймеров, как указано выше, чтобы определить относительное количество вирусных транскриптов.

По отношению к гену домашнего хозяйства хозяина Mavs является сокращением от митохондриальной противовирусной сигнализации, как показано здесь. Адаптерная молекула Mavs передает сигналы от цитозольных рецепторов глаза, чтобы активировать NF, каппа B и интерфероновые регуляторные факторы IRF, которые, в свою очередь, повышают экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферонов. Здесь показана вирусная нагрузка в легких мышей, инфицированных гамма-ВЧ дикого типа, и мышей-однопометников с дефицитом Mavs.

Дефицит Mavs значительно снижал вирусную нагрузку в легких через 10 дней после заражения, что указывает на то, что Mavs необходим для эффективной вирусной инфекции in vivo. На этом рисунке показана многоступенчатая кривая роста вируса на эмбриональных фибробластах мышей дикого типа, а также на фибробластах с дефицитом Mavs в Mavs. Значительно замедленный рост вируса на эмбриональных фибробластах мыши, указывающий на то, что Mavs необходим для эффективной репликации вируса in vitro мРНК вирусных литических генов в гамма-HV 68 инфицированных эмбриональных фибробластах мыши, которые были проанализированы методом ПЦР в реальном времени, значительно снизили уровни мРНК трех основных литических генов.

Все эти результаты в совокупности подтверждают вывод о том, что Mavs необходим для гамма-транскрипции HV 68, активации и литической репликации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как опрашивать взаимодействие патогена хозяина на нескольких уровнях, как в VO, так и в Vevo. Не забывайте, что работа с патогенами может быть крайне нерешительной.

Во время выступлений следует принимать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.