Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными В месте Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении генома вируса простого герпеса первого типа в срезах тройничных ганглиев у латентно инфицированных мышей методом флуоресцентной гибридизации in situ. Это достигается путем первичной инокуляции вируса в губу животного, за которой следует 28-дневный инкубационный период, в течение которого вирус закрепляется в тройничных ганглиях. Затем ганглии тройничного нерва собираются, встраиваются и крио секционируются.

Секции подвергаются нескольким подготовительным обработкам, в том числе ключевому этапу их нагрева в буфере цитрата натрия. Наконец, флуоресцентную гибридизацию in situ проводят с использованием флуоресцентных халатов, специфичных для герпеса. В конечном счете, результаты могут показать расположение вирусного генома внутри ядра индивидуально инфицированных нейронов с помощью конфокальной микроскопии.

Во многих случаях изучение различных жизненных циклов требует использования животных моделей. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она предоставляет данные на уровне одной клетки, используя подход «беглости института». Модель «королевского убийцы» инфекций ВПГ воспроизводит большинство аспектов естественной истории инфекции ВПГ 1 у человека.

Это естественный хозяин вируса. Первичная инфекция заносится в ткани полости рта, а затем вирус прогрессирует от губ к двум аль-ганглиям. Это основная сторона латентности HS V у человека в сочетании двух иммуно и окрашивания.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся латентности вируса герпеса, например, как вирус взаимодействует с ядерными компонентами и как эти взаимодействия повлияют на поддержание латентности и, в конечном итоге, на реактивацию вируса. Для начала возьмите мышь под наркозом и исходный раствор вируса HSV one. Ресуспендирован в фенольном красном свободном средстве.

С помощью бинокулярного стереоскопа введите иглу в субэпителиальный слой левой верхней губы на слизисто-кожной границе. Введите 0,5 микролитра вирусного раствора в течение пяти секунд, а затем сделайте вторую инъекцию вируса в тот же участок. Переложите мышь в инкубатор или грелку с температурой 37 градусов Цельсия до тех пор, пока она не проснется.

Затем поместите его в домашнюю клетку на необходимое время восстановления, прежде чем зафиксировать его в соответствии с текстовым протоколом. Разрез с каждой стороны нижней челюсти. Затем разрежьте кончик носа сразу за резцами, чтобы открыть носовую полость.

Разрежьте нёбо пополам ножницами, а затем отложите его в сторону. Ганглии тройничного нерва находятся ниже нёба. Они представляют собой белые продолговатые массы, длиной от двух до трех миллиметров, которые соединены с тройничным нервом.

Разрежьте ветви тройничного нерва с каждой стороны ганглий, чтобы освободить их от ствола мозга. С помощью хирургических плоскогубцев удалите ганглии и перенесите их на 20%Сахароза в PBS позволяет им инкубироваться в течение 24 часов. При комнатной температуре на следующий день вживите оба ганглия тройничного нерва в один блок криосекции.

Закладывая среду, заморозьте блок при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет разрезан на криостате. Разрежьте ганглии тройничного нерва вдоль на участки по 10 мкм и соберите их на супер морозных горках, прогретых до 30 градусов Цельсия. На одной горке может поместиться от четырех до пяти секций.

Может быть полезно присвоить слайду несколько серийных меток. Если планируется несколько последующих применений, дайте ломтикам высохнуть в течение пяти-10 минут, прежде чем хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для этого протокола зонд получают путем мечения косм, содержащих 30 килобазовых участков одного генома ВПГ, с помощью SI 3D CTP методом трансляции NIC.

Он осаждается и суспендируется в деионизированной форме амида и должен казаться розовым из-за включения S SI 3 в первый день. Поместите слайды на держатель слайдов при комнатной температуре и дайте секциям высохнуть в течение 10 минут. Затем регидратируйте срезы в одном XPBS в течение 10 минут.

Далее прокалывайте ткань в 0,5% Triton X 100 в одном XPBS в течение 20 минут. Затем вымойте слайды три раза по 10 минут за одну стирку двумя XSS и держите их в двух XSSC до тех пор, пока демаскирующий буфер не нагреется. Для демаскировки разогрейте цитратный буфер в микроволновой печи, пока буфер не закипит.

Это делается путем наполнения стеклянного лотка с предметными стеклами 200 миллилитрами буфера. Поместите лоток в емкость большего размера, наполненную 500 миллилитрами дистиллированной воды, и разогрейте буфер до закипания. Затем переложите слайды в лоток.

Убедитесь, что они полностью покрыты буфером в микроволновой печи. Нагрейте предметные стекла в буфере около 20 секунд, пока буфер не закипит. Не дайте буферу закипеть.

Затем охладите горки при комнатной температуре в течение двух минут и повторите цикл нагрева еще шесть раз. Крайне важно эмпирически определить количество и продолжительность циклов приема пищи для воспроизводимости этапа демаскирования. Микроволновая печь, поднос, контейнер, объем буфера в подносе.

Объем воды в емкости должен оставаться одинаковым после завершения нагрева. Перенесите предметные стекла в два XSSC на пять минут под вытяжной шкаф, инкубируйте предметные стекла в трех-одном-четырех растворах метанола, уксусной кислоты и PBS в течение 15 минут. Затем инкубируйте горки в свежеприготовленной смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении три к одному в течение 15 минут.

Теперь обезвоживайте секции с помощью последовательной 10-минутной инкубации в 70% этаноле, а затем двух 10-минутных инкубации в чистом этаноле. Дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы подготовить их к пробе. Нанесите по каплям на высушенные срезы 80 микролитров зондирующего раствора и накройте их покровным листом.

Убедитесь, что пробный раствор распространяется по всей поверхности защитного стекла и что на нем нет пузырей. Затем заклейте защитное стекло резиновым цементом и дайте ему высохнуть. Приступайте к денатурации, инкубируя предметные стекла при температуре 80 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем быстро переложите горки на металлический поднос со льдом на пять минут. После этого следует ночная гибридизация при 37 градусах Цельсия на следующий день. Удалите резиновый цемент щипцами с помощью предметных стекол на термоблоке с температурой 37 градусов Цельсия.

Аккуратно снимите чехол кончиком лезвия скальпеля. Далее повторно промойте срезы с помощью SSC. Теперь окрасьте образцы на 10 минут соответствующим красителем, таким как DAPI или крючки 3 3 3 4 2 по 0,5 микрограмма на миллилитр в одном XPBS.

Затем вымойте слайды три раза одним XPBS в течение 10 минут за одну стирку. После третьего мытья слейте как можно больше жидкости с горки. Затем в конце каждого слайда нанесите 80 микролитров монтажной среды с антивыцветающим средством.

Медленно накройте носитель защитным покрытием высокого оптического качества, не допуская образования пузырьков. Затем заклейте предметное стекло лаком для ногтей и храните его в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. При разработке этого протокола было протестировано несколько солевых буферов для демаскирования.

В то время как буферы ЭДТА имеют тенденцию повреждать ткани. Трис цитрата натрия, HCL и дистиллированная вода были пригодны для первого обнаружения ВПГ, чтобы убедиться, что протокол будет работать с коммерческими зондами. Обнаружение одного латентного генома ВПГ проводили с помощью биотинилированного зонда PAN HSV one, полученного от Enzo Biochem, можно было обнаружить как одиночные, так и множественные пятна для одного генома ВПГ.

Кроме того, протокол ДНК рыб был протестирован на мышах и кроликах, инфицированных тремя широко используемыми штаммами ВПГ 1. Во всех случаях геномы HSV one показали пятнистый сигнал с переменной яркостью и интенсивностью. Кроме того, применимость протокола была проверена в репликативном цикле ВПГ путем проведения ДНК-рыб на тканях мышей, перенесших общую герпетическую инфекцию.

У этих животных были обнаружены крупные и яркие агрегаты одного генома ВПГ в различных тканях, в том числе в глазах и мозге DRG. Протокол ДНК-рыб очень универсален. Это позволяет совместно обнаруживать один геном ВПГ и вирусные или клеточные РНК и белки.

Например, совместное обнаружение одного генома ВПГ вместе с одной широтной РНК ВПГ осуществимо; совместное обнаружение одного генома ВПГ с клеточными белками, такими как белок Centro MERIC, CE NPA A, совместное обнаружение ВПГ 1 с хроматином и ядерными тельцами PML. Ассоциированный белок A TRX визуализировали с помощью тройного окрашивания, показывающего HSV 1D NA красным цветом. Его продукт РНК имеет широту синего цвета, а TRX — зеленого.

После того, как разоблачение установлено, процедура анализа ДНК рыбы очень надежна. Это можно сделать менее чем за 24 часа партиями из 20 слайдов и более. Разработка этой методики позволит исследователям, изучающим вирусы герпеса и другие стойкие вирусы, изучить на уровне отдельных клеток, как клеточные компоненты и ядерная архитектура могут влиять на биологию этих вирусов.