Обнаружение генома и стенограммы о стойких вирусов ДНК в нейронных тканей люминесцентными В месте Гибридизация сочетании с Иммуноокрашивание

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении генома вируса простого герпеса 1-го типа в срезах тройничного узла латентно инфицированных мышей с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Для этого сначала вирус вводят в губу животного, после чего следует 28-дневный инкубационный период, в течение которого вирус закрепляется в тройничных узлах. Затем тройничные узлы извлекают, заливают в компаунд и подвергают криосекционированию.

Срезы подвергаются нескольким подготовительным процедурам, включая ключевой этап их нагрева в цитратном буфере натрия. Затем проводится флуоресцентная гибридизация in situ с использованием специфических флуоресцентных зондов на герпес. В итоге, с помощью конфокальной микроскопии можно определить локализацию вирусного генома внутри ядер отдельных инфицированных нейронов.

Во многих случаях изучение различных жизненных циклов требует использования моделей на животных. Основным преимуществом представленного здесь метода является получение данных на уровне отдельных клеток с использованием подхода к полноценному анализу в институте. Модель инфекции HS у королевских киллеров воспроизводит большинство аспектов естественного течения инфекции HSV 1 у людей.

Это естественный хозяин вируса. Первичная инфекция возникает в тканях полости рта, после чего вирус перемещается от губ к двуяремным ганглиям. Именно здесь в организме человека происходит основная латентность HSV. Объединение двух методов иммуноокрашивания.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся латентности герпесвируса, такие как характер взаимодействия вируса с ядерными компонентами и то, как эти взаимодействия влияют на поддержание латентности и последующую реактивацию вируса. Для начала подготовьте анестезированную мышь и исходный раствор вируса HSV-1, ресуспендированный в среде без фенолового красного.

С помощью бинокулярного стереомикроскопа введите иглу в субэпителиальный слой левой верхней губы на границе слизистой оболочки и кожи. В течение пяти секунд введите 0,5 µL вирусного раствора, после чего выполните вторую инъекцию вируса в то же место. Перенесите мышь в инкубатор с температурой 37 °C или на греющую подкладку до пробуждения животного.

Затем поместите животное в домашнюю клетку на необходимое время восстановления перед проведением перфузионной фиксации согласно текстовому протоколу. Сделайте разрезы с каждой стороны нижней челюсти. Затем отсеките кончик носа сразу за резцами, чтобы обнажить носовую полость.

Разрежьте нёбо ножницами пополам, затем отодвиньте его в сторону. Тройничные ганглии расположены под нёбом. Они представляют собой белые продолговатые образования длиной 2–3 мм, соединенные с тройничным нервом.

Перережьте ветви тройничного нерва с каждой стороны ганглиев, чтобы освободить их от ствола головного мозга. С помощью хирургического пинцета извлеките ганглии и перенесите их в 20% Sucrose в PBS; инкубируйте в течение 24 часов. На следующий день при комнатной температуре both trigeminal ganglia поместите в один блок для криосекционирования.

Заморозьте блок в среде для встраивания при температуре -80 °C до момента нарезки на криостате. Нарежьте тройничные узлы вдоль, получая срезы толщиной 10 micron, и соберите их на стеклах SuperFrost, подогретых до 30 °C. На одно стекло можно поместить от четырех до пяти срезов.

Маркировка предметного стекла несколькими сериями может быть полезной. Если планируется несколько последующих применений, дайте срезам высохнуть в течение пяти-10 минут перед их хранением при температуре минус 80 °C. В данном протоколе зонд подготавливают путем мечения козмов, содержащих участки генома HSV 1 длиной 30 kb, с помощью SI 3D CTP посредством трансляции NIC.

Осадок суспендируют в деионизированной форме амида; на первый день образец должен иметь розовый цвет благодаря включению S SI three. Поместите предметные стекла в держатель при комнатной температуре и дайте срезам высохнуть в течение 10 минут. Затем регидратируйте срезы в 1xPBS в течение 10 минут.

Затем проведите пермеабилизацию ткани в 0,5% растворе Triton X 100 в 1X PBS в течение 20 минут. После этого трижды промойте стекла по 10 минут каждое в 2X SS и храните их в 2X SSC до нагрева буфера для демаскирования. Для демаскирования предварительно нагрейте цитратный буфер в микроволновой печи до кипения.

Для этого в лоток для предметных стекол наливают 200 миллилитров буфера. Лоток помещают в более крупный контейнер, наполненный 500 миллилитрами дистиллированной воды, и предварительно нагревают буфер до кипения. Затем в лоток переносят предметные стекла.

Убедитесь, что предметные стекла в микроволновой печи полностью покрыты буфером. Нагревайте стекла в буфере около 20 секунд до закипания раствора. Не допускайте перекипания буфера.

Затем охлаждайте предметные стекла при комнатной температуре в течение двух минут и повторите цикл нагрева еще шесть раз. Для обеспечения воспроизводимости этапа демаскировки крайне важно эмпирическим путем определить количество и продолжительность циклов нагрева. Это зависит от микроволновой печи, лотка, контейнера и объема буфера в лотке.

Объем воды в контейнере должен оставаться неизменным после завершения нагрева. Перенесите предметные стекла в два XSSC на пять минут, работая в вытяжном шкафу, затем инкубируйте стекла в растворе метанола, уксусной кислоты и PBS в соотношении 3:1:4 в течение 15 минут. После этого инкубируйте стекла в свежеприготовленной смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 15 минут.

Теперь проведите дегидратацию срезов путем последовательных 10-минутных инкубаций в 70% ethanol, после чего проведите две 10-минутные инкубации в чистом ethanol. Оставьте стекла подсохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут для подготовки к нанесению зонда. Покапельно нанесите 80 µL раствора зонда на высушенные срезы и накройте их покровным стеклом.

Убедитесь, что зондирующий раствор равномерно распределился по всей поверхности покровного стекла и пузырьков воздуха нет. Затем загерметизируйте покровное стекло каучуковым клеем и дайте ему высохнуть. Приступайте к денатурации, инкубируя предметные стекла при 80 °C в течение пяти минут.

Затем быстро перенесите предметные стекла на металлический лоток со льдом на пять минут. После этого проведите гибридизацию в течение ночи при 37 °C на следующий день. Удалите резиновый цемент с помощью пинцета, поместив предметные стекла на термоблок при 37 °C.

Осторожно снимите покровное стекло кончиком лезвия скальпеля. Затем несколько раз промойте срезы раствором SSC. После этого окрашивайте образцы в течение 10 минут подходящим красителем, таким как DAPI или HOECHST 33342, в концентрации 0.5 µg/mL в 1x PBS.

Затем трижды промойте предметные стекла в 1 XPBS, выдерживая по 10 минут при каждой промывке. После третьей промывки максимально удалите жидкость с предметного стекла. Затем на край каждого стекла нанесите 80 µL среды для заключения с антифейдинговым агентом.

Медленно накройте среду покровным стеклом высокого оптического качества, избегая образования пузырьков воздуха. Затем загерметизируйте предметное стекло лаком для ногтей и храните его в темном месте при температуре четыре градуса Цельсия. При разработке данного протокола для демаскировки были протестированы несколько солевых буферов.

В то время как буферы с ЭДТА имели тенденцию повреждать ткань, трицинатрийцитрат, HCl и дистиллированная вода оказались подходящими для детекции HSV one, что подтвердило работоспособность протокола с коммерческими зондами. Детекцию латентного генома HSV one проводили с использованием биотинилированного зонда PAN HSV one от Enzo Biochem; при этом удалось обнаружить как одиночные, так и множественные паттерны расположения спотов генома HSV one.

Кроме того, протокол DNA FISH был протестирован на мышах и кроликах, инфицированных тремя широко используемыми штаммами HSV-1. Во всех случаях геномы HSV-1 демонстрировали точечный сигнал с вариабельной яркостью и интенсивностью. Дополнительно применимость протокола была проверена в рамках репликативного цикла HSV-1 путем проведения DNA FISH на тканях мышей с генерализованной герпетической инфекцией.

У этих животных в различных тканях, включая ганглии спинномозговых нервов (DRG), глаза и головной мозг, были обнаружены крупные и яркие агрегаты геномов HSV 1. Протокол FISH-анализа ДНК очень универсален. Он позволяет одновременно обнаруживать геном HSV 1, а также вирусные или клеточные РНК и белки.

Например, возможно одновременное обнаружение генома HSV-1 вместе с латентной РНК HSV-1. Для совместного обнаружения генома HSV-1 с клеточными белками, такими как центромерный белок CENP-A, использовались методы соосаждения. Совместная локализация HSV-1 с хроматином и ядерными тельцами PML была визуализирована с помощью тройного окрашивания, при котором ДНК HSV-1 была окрашена в красный цвет, продукт ее транскрипции латентная РНК — в синий, а белок ATRX — в зеленый.

После настройки этапа демаскирования процедура FISH с использованием ДНК становится очень стабильной. Она может быть выполнена менее чем за 24 часа партиями по 20 и более предметных стекол. Разработка этого метода позволит исследователям, изучающим вирусы герпеса и другие персистирующие вирусы, исследовать на уровне отдельной клетки, как клеточные компоненты и архитектура ядра могут влиять на биологию этих вирусов.