Двухфотонная микроскопия для изучения притяжения микроглиального процесса к соединению в срезе мозга мыши

Поместите срез мозга мыши в перфузионную камеру, содержащую aCSF, под двухфотонный микроскоп.

Мышь генетически спроектирована для экспрессии GFP в микроглии, что позволяет отслеживать движения микроглии.

Закрепите ломтик держателем.

Используя светлопольное освещение, найдите интересующую область.

Переключитесь на флуоресцентное освещение, чтобы визуализировать микроглию.

Наполните микропипетку тестируемым составом, установите ее на держатель шприца и опустите, чтобы коснуться среза.

Активируйте двухфотонный режим визуализации, фокусируя низкоэнергетический свет ближнего инфракрасного диапазона в ткани.

В фокусной точке лазера два фотона объединяют свою энергию для возбуждения GFP, излучая флуоресценцию.

Захватывайте изображения в нескольких Z-плоскостях, чтобы сосредоточиться на процессах микроглии.

Запишите базовую активность, затем введите соединение и продолжите запись.

Соединение связывается с рецепторами микроглии, запуская сигнальные пути, которые стимулируют распространение микроглиального отростка к источнику соединения.

Отслеживайте увеличение флуоресценции вблизи места инъекции с течением времени, чтобы отслеживать движение.

30 минут до начала записи, подключите перистальтический насос к специальной камере записи с верхней и нижней перфузией для оптимизации насыщения кислородом и жизнеспособности срезов тканей и очистите всю систему перфузии 50 миллилитрами сверхчистой воды. В конце цикла очистки начните перфузию записывающей камеры с 50 миллилитрами aCSF в стеклянном стакане под постоянной карбогенацией и с помощью одноразовой пипетки с широким горлышком перенесите первый срез для изображения в стакан для удаления линзовой бумаги.

Когда секция опустилась на дно стакана, перенесите секцию в камеру записи и поместите держатель среза на срез, чтобы свести к минимуму движение, вызванное потоком перфузии. Используйте светлопольное освещение для нацеливания на интересующую область мозга при увеличении от 5 до 10 раз. Затем используйте объектив с 25-кратным увеличением и линзой для погружения в воду с 0,35-кратным увеличением для регулировки положения поля обзора.

Используйте флуоресцентное освещение, чтобы найти флуоресцентные микроглиальные клетки, и заполните пипетку 10 микролитрами aCSF, содержащими интересующее соединение в его конечной концентрации. Направьте наконечник вниз с помощью осторожного встряхивания, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие в наконечник, и установите заполненную пипетку в держатель для пипетки, соединенный со шприцем объемом 5 миллилитров, с поршнем, расположенным в положении 5 миллилитров и установленным на трехосевой микроманипулятор.

Осторожно опустите пипетку к срезу, одновременно контролируя и регулируя цель, пока кончик пипетки слегка не коснется поверхности среза. Теперь настройте лазер и переключите микроскоп в многофотонный режим. Убедитесь, что камера экранирована от любых источников света, и включите детекторы, не подвергшиеся сканированию. Установите усиление и используйте таблицу поиска с верхним пределом цветовой кодировки, чтобы избежать насыщения пикселей в изображении.

Затем начните запись в общей продолжительности не менее 30 минут, медленно нажимая на поршень шприца с 5 до 1 миллилитра через пять минут в течение 5 секунд, чтобы нанести соединение на участок. Для анализа изображения сначала выполните Z-проекцию и коррекцию дрейфа с помощью ImageJ на интересующем файле. Затем откройте измененный файл в цвете Icy и нарисуйте круглую область интереса диаметром 35 микрометров с центром над местом инъекции.

Запустите фильм еще раз с ROI, чтобы убедиться, что он правильно позиционирован. Затем используйте плагин Intensity Evolution для области интереса для измерения средней интенсивности с течением времени в интересующей области и сохраните результаты в виде файла .xls.