Двухфотонная визуализация динамики микроглии в гиппокампе мыши in vivo

Возьмем, к примеру, трансгенную мышь под наркозом, экспрессирующую флуоресцентные белки в микроглии. Закрепите его на стереотаксической раме с моторизованным предметным столиком под двухфотонным микроскопом.

Череп оснащен металлической трубкой со стеклянным дном, которая мягко сплющивает альвеус над областью рогового аммониса гиппокампа 1 или CA1, обеспечивая четкий оптический интерфейс без

чрезмерного давления на подлежащие ткани.

Наполните металлическую трубку водой для оптимизации оптического пропускания.

Активируйте импульсный лазер на длине волны возбуждения.

Используя флуоресценцию паренхимы мозга и отраженный свет от металлической трубки, отрегулируйте фокус на области CA1.

Переместите голову мыши так, чтобы дно стекла было выровнено параллельно плоскости изображения, обеспечивая равномерный фокус по всему полю зрения.

Настройте объектив для оптимального разрешения и наблюдайте динамику микроглии in vivo в области CA1.

Затем сделайте снимок зубчатой извилины, где флуоресцентная микроглия подтверждает целостность CA1.

Установите мышь в устройство для удержания головы под объективом двухфотонного микроскопа и на моторизованный сканирующий столик XY. Затем заполните пространство между дном стекла и линзой объектива водой, не создавая пузырьков воздуха. Отрегулируйте фокус на CA1 под руководством флуоресценции, излучаемой паренхимой мозга, и отраженного света от края металлической трубки при непрерывном освещении импульсным лазером.

Отрегулируйте угол наклона головки мыши, наклонив устройство удержания головы так, чтобы стеклянное дно было параллельно плоскости изображения. Затем отрегулируйте корректирующее кольцо объектива, чтобы достичь наивысшего разрешения на глубине целевой структуры в CA1. Затем убедитесь, что флуоресцентные клетки в молекулярном слое зубчатой извилины, или DG, на глубине 500 микрометров от стеклянного дна, визуализированы во всем поле зрения. Только в случае успешной операции сигналы DG могут быть обнаружены немедленно.

Убедитесь, что микроглия восстановила свою разветвленную морфологию. Затем выполните визуализацию in vivo на интересующем слое в CA1.