Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

Общая цель этой процедуры — узнать о лентивирусной упаковке. Пятидневный протокол. В первые сутки, 2 9 3, клетки-продуценты TN покрываются с расчетной плотностью.

На вторые сутки клетки трансфицируют с помощью векторной конструкции ленти по выбору, содержащей интересующий ген и смесь плазмид в вирусной упаковке. На четвертый день вирусное состояние собирают и концентрируют путем добавления раствора для осаждения вируса ПЭГ. Заключительными этапами процедуры являются сбор концентрированного вируса ПЭГ, аликвотирование вируса и заражение клеток концентрированным вирусом для вирусного титрования.

В конечном счете, количественная ПЦР стабильно интегрированных генов используется для расчета количества стабильных интегрированных конструкций. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как трансфекция плазмы или ретровирусная трансдукция, заключается в том, что оптимизированный протокол упаковки лентивируса ФБР производит функционально активный вирус с высоким титром, который обеспечивает эффективную доставку практически в любую клетку млекопитающих, включая трудно поддающиеся трансфикации клетки, такие как стволовые клетки и неделящиеся первичные клетки. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не знакомы с мелкими деталями протокола, которые необходимы для успешного производства вируса с высоким титром.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как плотность клеток, визуализированная через микроскоп во время трансфекции, определяет эффективность упаковки вируса, которая определяет конечный титр вируса. В тех случаях, когда это применимо, экспрессия флуоресцентного репортера определяет эффективность трансфекции, которая оказывает существенное влияние на конечный титр вируса. Кроме того, визуальная демонстрация этого метода полезна для исследователей, чтобы ознакомиться с тонкими, но важными частями протокола, такими как передовые методы поддержания стерильности в течение всего процесса и способы предотвращения включения клеточного мусора в собранный вирус.

Эффективная упаковка лентивирусов опирается на три компонента. Во-первых, вектор экспрессии лентивируса должен содержать некоторые элементы, необходимые для упаковки вируса и стабильной интеграции, а также элементы для экспрессии интересующего гена. Короткая шпилька, РНК, микроРНК или репортерная кассета.

Во-вторых, плазмиды упаковки лентивируса должны обеспечивать белки, необходимые для упаковки РНК-копии экспрессионной конструкции в рекомбинантные псевдовирусные частицы и последующей обратной транскрипции и интеграции вируса при инфицировании. В-третьих, клетки-продуценты 2 9 3 TN должны быть временно пересечены с векторами экспрессии и упаковки. Эти клетки производят псевдовирусные частицы с высокими титрами, которые собираются из питательных сред.

В конечном счете, успешная трансдукция клеток-мишеней в основном зависит от количества вирусных частиц в клетке для данного типа клеток. Другими словами, множественность инфекции начинается с выращивания 2 9 3 TN клеток. В 15-сантиметровых клеточных культуральных планшетах в течение 18-24 часов для получения 60-80% беглости

Во время трансфекции каждая пластина дает примерно 14 миллионов клеток для увеличения выхода вируса. На следующий день можно использовать более одной пластины, когда клетки 2 9 3 TN сливаются на 60-80%, они готовы к трансфекции. На каждую пластину клеток добавьте по 1,6 миллилитров свободной сыворотки DMEM в 15-миллилитровую соколиную пробирку.

Затем добавьте 22,5 микрограмма ppac H one или Ppac F1 и 4,5 микрограмма вашего вектора ленти Construct в DMEM и перемешайте пипетированием вверх и вниз. Затем добавьте 55 микролитров чистого лакса в ту же пробирку и ввергните в течение 10 секунд, после чего проведите 15-минутную инкубацию при комнатной температуре. Через 15 минут добавьте по одной трубке в каждую культуральную пластину.

Затем осторожно поверните планшет по каплям, затем инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом через 48 часов. Если конструкция вектора ленти экспрессирует флуоресцентный ген, такой как GFP, проверьте клетки под микроскопом, успешная трансфекция даст от 50 до более чем 90% зеленых флуоресцентных клеток, которые теперь собирают надосадочную жидкость клеточной культуры в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Надосадочная жидкость содержит инфекционные псевдовирусные частицы.

Любые клетки, оторванные от пластины, не окажут негативного влияния на выработку вируса. Для удаления мусора центрифугой, вирусной надосадочной жидкостью при 1500 G в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем, не потревожив гранулу, соберите вирусную надосадочную жидкость, обязательно оставив буфер около 500 микролитров надосадочной жидкости и приступайте к следующему этапу, который заключается в концентрации вирусных частиц через 72 часа после трансфекции.

Необязательный второй забор вирусного суперната может быть выполнен с использованием той же техники после сбора вирусного сата. Концентрируется путем добавления одного объема ледяного раствора для осаждения вируса колышки к каждымся четырем объемам надосадочной жидкости в полипропиленовой центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров. Переверните раствор, чтобы перемешать его.

Никогда не используйте вихревой крем, затем храните раствор без перемешивания при температуре четыре градуса Цельсия до 96 часов. После минимум 12 часов охлаждения центрифугируйте смесь при температуре 1500 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осажденные частицы лентивируса пегго появятся в виде бежевой или белой гранулы на дне пробирки.

Теперь удалите все следы жидкости с помощью тщательной аспирации, не нарушая осажденные частицы лентивируса в грануле. В качестве альтернативы удалите большую часть наднатина и повторно суспендируйте гранулу в оставшемся супинате. Затем переложите суспензию в стерильную двухмиллилитровую пробирку эйнора и центрифугируйте пробирку в холодном микрофуге в течение двух минут.

При 14 000 об/мин пипетка удаляет оставшуюся надосадочную жидкость и ресуспендирует гранулу лентивирусных частиц в холодном, стерильном буфере в диапазоне от одной 10-й до одной 100-й. Исходный объем тщательно дозируйте гранулу в раствор, не создавая пузырьков, сохраняя его всегда холодным. Убедитесь, что пеллета полностью суспензирована.

Наконец, сделайте от 15 до 25 микролитров аликвот чернил, стерильные криогенные флаконы на льду и храните флаконы при температуре минус 70 градусов Цельсия. Успешный тираж упаковки позволит получить от 10 до 1000 миллионов инъекций на миллилитр для передачи вируса в 24-луночный планшет с культуральными планшетами, 50 000 клеток на лунку и вырастить их в течение ночи в заданных условиях культивирования. Клетки должны быть на 50-70% слитыми для трансдукции с целью титрации.

Клетки HT 10 80 могут быть использованы в качестве легко трансдуцируемых контрольных клеточных линий: на следующий день аспирация среды из клеток. Затем соедините питательную среду с концентрированным утиным раствором. Таким образом, конечная концентрация транс-уток равна одному х, добавьте полмиллилитра трансдуцированного вещества в каждую лунку с клетками-мишенями при правильной плотности от 50 до 70% Со, добавьте вирус в каждую лунку в следующих разведениях, один к 100, один к 10, и прямое разведение один к одному.

Вирус может оставаться в контакте с клетками-мишенями до 72 часов без смены среды. Через 72 часа провирус будет стабильно интегрирован в геном хозяина и будет экспрессировать интересующий ген. Если экспрессия флуоресцентных маркеров в настоящее время может быть использована для оценки эффективности трансдукции при различных разведениях вируса, то количество инфекционных единиц может быть количественно определено с помощью QPCR.

После того, как титр вируса известен, рассчитайте подходящий объем вируса для достижения желаемой множественности инфекции для других клеток-мишеней. Измерение титра и контроль MOI обеспечивает согласованность между экспериментами и различными вирусными препаратами. Теперь вирус готов к использованию в дополнительных экспериментах.

Начальная плотность клеток 2 9 3 TN имела решающее значение для успешной упаковки вируса в день трансфекции. Эти 2, 9, 3 TN-клетки были на 60-80% слиты. Через 24 часа после успешной трансфекции ленти-вектором, экспрессирующим GFP, было обнаружено, что по крайней мере 90% из 2 9 3 TN клеток показали зеленую флуоресценцию.

Через 72 часа после трансдукции GFP продолжала экспрессироваться в клетках-хозяевах HT 10 80. Это указывает на то, что лентивирусная конструкция, стабильно интегрированная в геном хозяина, трансдуцируя те же клетки-хозяева при десятикратном разведении пропорционально снижала экспрессию GFP. Потому что связь между титром вируса и опосредованной лентивирусом экспрессией генов прямо пропорциональна.

После освоения этой техники ее можно выполнять в течение пяти дней примерно по одному-два часа в день, если она выполняется правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как эффективно и безопасно упаковать функционально инфекционные вирусные частицы и успешно трансдуцировать клетки вируса. Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть опасной, и меры предосторожности, такие как работа в BSL с двумя культуральными культурами тканей.

Во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать лабораторный халат и перчатки.