Сотовые Захват Использование микрожидкостных устройств

Устройства в том виде, в котором мы их подготовили, упакованы в комплекты по 10 или 20 штук, и когда они прибывают, они отправляются холодными в коробке, и комплект содержит все компоненты, которые вам нужны для работы. Эксперимент в наборе заключается, представляет собой пакетик со всеми шприцами и буферами, которые могут оставаться при комнатной температуре. Также есть копия протокола, которому мы будем следовать в этом эксперименте.

Есть также холодильная коробка, в которой находятся сами устройства и все работающие буферы, которые необходимо охлаждать. Как правило, наборы упаковываются группами по 10 или 20 штук. Когда наборы не используются, их следует хранить в холодильнике.

Каждый шприц и каждый компонент набора тщательно промаркированы, и этикетки соответствуют таблице в протоколе, которому мы следуем. Таким образом, нет никакой двусмысленности в отношении того, какой шприц или компонент набора следует использовать на отдельных этапах. После распаковки устройств и помещения их в шкаф биологической безопасности, мы выполним процедуру выделения нейтрофилов и лизирования их для последующих геномных приложений, потому что спасение жизни, которое мы получим, будет использовано для выделения или извлечения РНК из клеточного лизата.

Поэтому мы хотим быть уверены, что наша территория чиста, не только в стерильном смысле, но и чиста от любых РНК, которые обычно присутствуют в окружающей среде. Поэтому очень важно протереть всю территорию и устройства раствором, который уничтожает РНК. Так что, как правило, мы протираем все наши инструменты и рабочие поверхности с помощью РНК, SAP или РНК, которые вы можете получить у ряда производителей.

Прибор поставляется в упаковке с термосвариваемым чехлом. На каждое устройство наносится пломба и штрих-код этого штрих-кода. Вы должны записать этот штрих-код, если вы работаете с какими-либо клиническими образцами.

Итак, устройство разгерметизировано, крышка снята и помещена в коллектор насоса. Образец крови, который мы используем, является образцом цельной крови. Мы пропустим его через стандартный шприц BD длиной в один мил, и он будет помечен как шприц-один.

Как правило, шприц извлекается из упаковки и колпачок осторожно снимается с пробирки с кровью. И что вы делаете, это капаете 700 микролитров или 0,7 мила крови и вводите половину этого или 350 микролитров в 1,5-миловую трубку. Спасибо. Таким образом, ваша кровь может быть передана для дальнейшей обработки.

Ваша пробирка с кровью может быть проведена, и все же у вас все еще остается больше крови в случае отказа устройства. Итак, что мы собираемся сделать, так это загрузить шприц, в который поступает кровь, на эту иглу, которая соединена с куском трубки с помощью этого устройства. Мы хотим быть очень близкими к микрофлюидному изолирующему устройству.

Мы хотим быть очень осторожными, чтобы не занести пузырьки воздуха внутрь устройства, иначе устройство будет неисправно. Как правило, мы берем шприц, нажимаем на поршень и добавляем жидкость на верхнюю поверхность устройства, убеждаемся, что он полностью сцеплен, прежде чем мы выпустим всю жидкость. Мы останавливаемся и осторожно извлекаем корпус шприца из иглы и заполняем кончик иглы или, или соединитель приманки иглы, оставшимся буфером, который находится в этом шприце

Мы избавляемся от этого. Затем мы возьмем наш шприц с кровью и вставим его в эту втулку приманки. Будьте осторожны, чтобы не пролить кровь и не занести пузырьки воздуха.

Сочтите, что лучше всего использовать кемо, держа корпус шприца и трубку на случай пролития крови. После того, как шприц подсоединен к корпусу трубки или игле, мы делаем несколько резких нажатий, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые могут находиться на разъеме. Затем этот шприц загружается в шприцевой насос, а затем фиксируется стопорным винтом.

Шприцевой насос включен и уже настроен на наши условия потока. Мы будем пропускать эту кровь через устройство со скоростью 30 микролитров в минуту. Как только корпус шприца будет загружен в шприцевой насос, мы собираемся нажать кнопку на подвижном рычаге поршня и сдвинуть его вниз, пока он не коснется верхней части поршня и не начнет выталкивать жидкость через его кончик.

Это тупой кончик, игла из нержавеющей стали. Как только мы убедимся, что система подготовлена, мы нажмем кнопку «Запустить». Чтобы начать поток крови, вы нажимаете стоп, чтобы остановить его, а затем берете чистую центрифужную пробирку 1,5 мил или трубку фендора, и мы собираемся осторожно отключить вилку.

Отсоедините только одну, отсоедините трубку от одного порта устройства. Как только эта трубка будет отключена, мы вставим ее в трубку фендора 1,5 мил. Мы нажмем кнопку «Бег», чтобы снова начать кровоток.

И когда мы видим каплю крови, мы останавливаем насос и вставляем его в входное отверстие, которое мы только что открыли в устройстве. Мы нажмем кнопку «Бег», чтобы начать поток крови, и установим таймер на пять минут. Мы хотим убедиться, что кровь равномерно заполняет все камеры и что в устройстве нет явных пузырьков воздуха.

Если есть пузырьки воздуха, которые блокируют поток в какую-либо из камер, вы можете взять пару пинцетов и провести их по маленьким каналам, которые ведут вверх к камерам захвата, или по маленьким каналам, выходящим из камер захвата. Это устройство хорошо заполняется, поэтому через пять минут вы нажимаете стоп на шприцевом насосе, чтобы остановить поток крови, ослабляете зажим для шприца и вынимаете его из держателя шприца. Затем мы собираемся использовать шприц номер три, который загружен PBS, не содержащим нуклеаз. Мы собираемся использовать, мы в основном собираемся, снова убедиться, что поверхность устройства сцеплена, чтобы избежать пузырьков воздуха, мы постукиваем по шприцу, чтобы сделать их, убедитесь, что любые пузырьки воздуха находятся в верхней части корпуса шприца.

Ослабьте рычаг на шприцевом насосе и вставьте в него шприц с тремя мельницами. Затяните его, а затем нажмите на поршень вниз, пока он не соприкоснется с поршенем шприца. Мы нажимаем кнопку «Бежать» и ждем, пока жидкость заполнит устройство, и мы ждем, пока на кончике иглы из нержавеющей стали появится капля.

Когда вы видите образование капель, вы останавливаете насос. Мы собираемся удалить кровь, наконечник из нержавеющей стали, на котором находится кровь. Мы вставим буфер для промывки и нажмем кнопку run.

И мы позволим этому продолжаться пять минут. И вы должны взять чистую салфетку и просто вытереть любое небольшое количество крови, которое может быть на входе или выходе После пяти минут промывки буфера через устройство, устройство должно быть полностью очищено от любой крови, и вы можете видеть, что в основном в устройстве не останется никакой красной крови. Устройство будет выглядеть четким. Итак, что мы собираемся сделать, это через пять минут, мы остановим работу буфера для стирки.

И снова, мы собираемся снять шприц со шприцевого насоса. Мы собираемся закрыть пробирку микроцентрифуги диаметром 1,5 мил прямо на гибкой выпускной трубке. И мы собираемся осторожно поднять трубку, микроцентрифугу, вытягивая трубку для отходов из устройства.

Мы собираемся выбросить это в контейнер для биологически опасных веществ. В комплекте идет новая выходная трубка, которая на самом деле изготовлена из тефлона. На нем снова есть наконечник из нержавеющей стали.

Мы собираемся заменить старую выпускную трубку на эту новую выпускную трубку. Мы возьмем эту выходную трубку и попытаемся согнуть ее вокруг U- или V-образной формы. В комплект также входит колонка для измельчения кайи, которая срезает ДНК и в основном гомогенизирует вашу клеточную жизнь.

Итак, мы собираемся, мы откроем фиолетовую крышку колонны измельчителя и поместим выпускную трубку в колонну измельчителя Kay. Мы вытащим из набора шприц номер два, на котором написано, что для RLT мы будем его использовать. Это стандартный шприц BD длиной один мил с тупым наконечником 22 калибра, нержавеющая сталь.

Мы собираемся использовать его для введения 350 микролитров стандартного RLT из kyogen в устройство. Поскольку устройство имеет мертвый объем около 50 микролитров, мы хотим ввести RLT, но за RLT мы хотим ввести пробку воздуха, чтобы выпустить этот мертвый объем устройства в колонну измельчителя чи. Итак, мы делаем это следующим образом: мы берем наш шприц, тянем, набираем 350 микролитров воздуха, а затем 350 микролитров или 0,35 мил RLT, и RLT оказывается на дне шприца.

Не поддавайтесь искушению перевернуть шприц и ввести воздух. Воздух там есть, чтобы убедиться, что мы получим весь RLT в нашу колонну измельчителя Kay. Мы собираемся вытащить трубку из буфера для промывки.

Мы вставим наш шприц с RLT и будем медленно вводить RLT в устройство в течение примерно 30 секунд, убедившись, что выпускная трубка выбрасывает свои отходы в колонну измельчителя ци. Как только воздух начинает впрыскиваться в устройство, вы нажимаете на шлюмпер и ждете, пока вся жидкость будет выпущена в колонну измельчителя Kay. Мы подключаем колонну измельчителя Kay и вращаем ее на микроцентральном плавке с балансом на 15 000 оборотов в минуту или максимальных оборотах в минуту на настольном микроцентральном предохранителе в течение двух минут.

Итак, после вращения колонки в течение двух минут, мы собираемся извлечь из нее образец, который теперь находится в RLT, и поместить его в один из прилагаемых криопробирок с фиолетовой крышкой. Если вы работаете с клиническим образцом, возьмите образец из этих криопробирок, вы наклеите на него этикетку в начале эксперимента. Вот лизат в криопробирке.

Этот криофлакон немедленно помещается в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов AC C и хранится для отправки или последующей экстракции РНК. Так что это альтернативный протокол для выделения нейтрофилов. Вместо того, чтобы лизировать клетки с помощью буфера RLT, мы собираемся окрашивать их стандартным гистологическим окрашиванием.

Пятно. Итак, мы достаем запечатанное устройство из пакета и снова разворачиваем его, записываем номер партии на устройстве и помещаем чашку Петри. В держателе для чашки Петри.

Мы возьмем один мил шприц из мешка, шприца номер один, загрузим в него 700 микролитров крови и введем половину из них 350 микролитров в пробирку DPH. Мы оставим это в стороне. Возьмите шприц номер четыре, который имеет трубку, которую мы будем использовать для выбора, введите кровь в устройство.

Будем проводить основание иглы от кончика трубки химическим способом. Снимите корпус шприца и наполните приманку. Адаптер будет буферизовать и утилизировать этот шприц.

Мы вставим шприц, содержащий кровь, в иглу с помощью химической салфетки, чтобы собрать любые побочные эффекты. Постукиваем по шприцу, чтобы удалить пузырьки воздуха в месте соединения иглы и корпуса шприца. Мы загрузим шприц в шприцевой насос, мы заполним трубку, нажав на движущийся рычаг шприцевого насоса.

Мы отсоединим трубку от одного из выходов устройства, устройства захвата, и поместим ее в трубку Эйнора 1,5 мил. А затем мы начнем течь кровью, нажимая на насос шприца. Подождем, пока на кончике из нержавеющей стали не образуется капля крови.

Как только капля сформируется, вы нажимаете стоп, капаете кровь, вставляете ее в устройство и нажимаете «Запустить». Теперь устанавливаем таймер на пять минут. Хорошо, после протекания через устройство в течение пяти минут, нажмите стоп на шприцевом насосе и отпустите шприц.

И мы заменим этот шприц на шприц на три мила, содержащий наш буфер для промывки, который представляет собой всего один XPBS. Опять же, мы хотим убедиться, что верхняя часть устройства сцеплена, а затем мы собираемся удалить кончик иглы, содержащий кровь или плюс. Начните грунтовку устройства.

Мы собираемся формировать капли, вставляем их в устройство и нажимаем кнопку «Пройти», промокаем кровь на входе или выходной трубке, и мы даем ей течь в течение пяти минут после этапа промывки. Снова остановим шприцевой насос и извлечем шприц из держателя насоса. Чтобы провести стандартное поддержание GIM, мы сначала починим клетки и обезвожим их с помощью 100% метанола.

Итак, у нас есть шприц, шприц на три мила, предварительно загруженный метанолом. Опять же, мы заправим шприц, убедимся, что метанол течет, остановим насос для шприца, вставим его в устройство и нажмем кнопку «Запустить». Мы собираемся закрепить их в этом растворе метанола на две-четыре минуты.

Итак, после двух-четырех минут фиксации и метанола, мы останавливаем насос, выпускаем шприц с метанолом, и здесь мы собираемся загрузить шприц, трехмиловый шприц, содержащий стандартный eem sustain eem sustain из Sigma, разведенный от одного до пяти в деионизированной воде. После того, как мы разбавили, мы загрузили его в шприц и на конце шприца прикрепили фильтр 0,8 микрона, чтобы отфильтровать любые частицы, которые попадут внутрь и которые в конечном итоге засорят устройство. Пятить от пяти до 10 минут.

А потом будем полоскать водой Deion i's. Итак, после 5-10 минут окрашивания, мы остановим шприцевой насос и заменим шприц с буфером для окрашивания на шприц, который содержит деионизированную воду, мы будем промывать до тех пор, пока не увидим, что синий цвет SAI был смыт с устройства. После того, как излишки гима были смыты с устройства, мы прекращаем промывку раствора.

И затем мы собираемся извлечь водяной шприц из входного отверстия. Затем мы возьмем выходную трубку устройства. Мы собираемся захватить эту трубку в конце пинцетом.

Это гибкая трубка тигона, которую мы собираемся вставить обратно во входное отверстие устройства. Это герметизирует устройство и сохраняет клетки увлажненными, а их морфологию нетронутой. Теперь мой коллега, доктор Джон Хонг Чанг, покажет альтернативный протокол выделения четырех положительных лимфоцитов CD с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием непосредственно в микрофлюидном устройстве.

Итак, меня зовут Шонг Хонг, и сегодня я собираюсь продемонстрировать вам окрашивание клеток в микрофлюидном устройстве, на данном этапе уже может показать вам, как использовать устройство для выделения микрофликов иммуноаффинного сродства для специфического выделения клеток крови из беспрецедентной цельной крови. Для своей цели он хочет провести liclicing на клетках и получить содержание белка и ДНК из этих изолированных клеток. Ну, с целью моего исследования, я заинтересован в том, чтобы получить клетки, а затем получить количество клеток, например, получить количество клеток CD из цельной крови и использовать это в качестве индикатора для диагностических целей.

Так что использование устройства очень похоже на устройство Кена. Он изготовлен из прямой камеры P-D-M-S-A. Геометрия немного отличается, поэтому параметры работы немного отличаются, в то время как в целом общая процедура работы очень похожа.

Поэтому я пропущу все этапы захвата и промывки клеток и перейду непосредственно к этапу окрашивания клеток в процедурах подсчета клеток. Итак, у меня есть устройство, которое уже состоит из половины клеток, взятых из цельной крови, и устройство уже промыто PBS. Итак, исходящие клетки уже вымыты из устройства, и я заранее подготовил смесь антител, которая используется специально для маркировки клеток, выделенных в устройство.

Таким образом, концентрация антител, которую мы использовали здесь, была оптимизирована для окрашивания клеток с очень высокой интенсивностью флуоресценции под флуоресцентным микроскопом. Так что процедура довольно проста. Мы загружаем шприц, наполненный раствором антитела, в шприцевой насос и затем убеждаемся, что скорость потока установлена на правильные параметры, которые нам нужны.

Затем мы запускаем шприцевой насос, следим за концом трубки, следим за тем, чтобы раствор уже вышел, чтобы в трубке больше не было пузырьков. А затем мы можем подключить трубку к микрофлюидному устройству, в которое мы улавливаем клетки. Итак, теперь антитела поступают в устройство, чтобы окрашивать клетки, которые мы выделили в устройстве, скорость потока здесь, я использую пять микролитров в минуту, но в зависимости от геометрии устройства, могут быть разные параметры потока, которые вы хотите использовать для своих целей.

И мы будем вливать раствор антитела в течение пяти минут, что достаточно для того, чтобы заменить весь раствор в микрофозном канале. Таким образом, после введения антител мы остановим поток. Итак, мы вводим антитела со скоростью пять микролитров в минуту в течение пяти минут, чтобы заменить весь раствор в микроканале.

После этого мы останавливаем поток и даем устройству инкубироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Поэтому это следует делать в темноте, чтобы антитела не гасли, пока клетки, флуоресцентные антитела могут гаснуть, пока клетки инкубируются с окрашивающим антителом. Таким образом, после окрашивания в течение обычно от 15 до 30 минут, мы просто отсоединяем трубку от устройства и заменяем шприц с антителами буферным шприцем, чтобы смыть несвязанное антитело с устройства.

Таким образом, моющий раствор здесь содержит 1% BSA в растворе PBS. BSA используется для блокировки несвязывания антител на поверхности, и мы сделаем то же самое. Итак, сначала мы регулируем скорость потока на шприцевом насосе, чтобы убедиться, что это правильная скорость потока, которую мы хотели, а затем мы запускаем шприцевой насос и убеждаемся, что жидкость действительно выходит из трубки, прежде чем мы вставим его в устройство.

Цель этого заключается в том, чтобы в трубке не оставалось пузыря, как остатки. Поэтому, когда мы вводим впрыскивание, ни один пузырь не попадает в наше устройство. Поэтому мы просто вставляем трубку в устройство и даем ей течь еще пять минут, чтобы заменить все вымываемые, все несвязанные антитела из устройства.

После этапа промывки мы закрепим ячейки 1% PFA. Цель этого заключается в том, чтобы устройство можно было хранить от нескольких недель до нескольких недель, если визуализация может быть выполнена сразу. Так что процедура довольно проста.

Это похоже на то, что мы делали раньше. Мы загружаем шприц в насос, регулируем скорость потока до желаемой, а затем запускаем шприцевой насос и подключаем трубку к нашему устройству, чтобы ввести раствор paraform IDE, который является фиксатором в наше устройство для фиксации клеток. Снова даем ему течь около пяти минут.

Таким образом, PFA заменяет весь буфер в устройстве, чтобы зафиксировать все ячейки в устройстве. Итак, после этапа фиксации PFA, мы просто снимаем шприц PFA, и теперь устройство готово к визуализации. В некоторых случаях люди хотят, чтобы окрашивание ядра накладывалось на окрашивание маркером клеточной поверхности.

Поэтому для этой цели будем делать окрашивание ядер с помощью DPI в конце. Итак, мы просто загружаем шприц DPI при включении шприцевого насоса и подаче DPI в наше устройство. Итак, теперь ядро будет окрашено в этих клетках, чтобы показать расположение клеток.

И это изображение окрашивания DPI может быть позже наложено на окрашивание поверхностным маркером, чтобы показать, где находятся клетки. Итак, по окончании окрашивания DPI нам нужно снова смыть L полосу DPI P буферным раствором. Итак, опять же, мы используем PBS, содержащую 1% BSA, для смывания исходящего dpi.

И операция аналогична тому, что мы делали раньше. Мы просто подключаем буферный шприц к нашему устройству и позволяем буферу течь в устройство, чтобы смыть несвязанный dap. Вот и вся процедура окрашивания клеток в микрофлюидном устройстве

И после всех процедур окрашивания аппараты готовы к визуализации. А поскольку мы проводили фиксацию PFA, устройства также могут храниться в течение нескольких недель. Если визуализация изображения не может быть выполнена сразу.