Оценка раковых стволовых клеток миграции с помощью Compartmentalizing микрофлюидных устройств и изображений живых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в визуальном осмотре и описании миграции раковых клеток с помощью микрофлюидного устройства. Это достигается путем первой диссоциации, ранее существовавших нейросфер стволовых клеток опухоли головного мозга, выращенных в свободной от сыворотки среде. Вторым шагом является изготовление двухслойной мастер-формы SU eight с использованием мягкой литографической формы штампа A-P-D-M-S, которая имеет разделяющую конструкцию.

Далее соберите микрофлюидное устройство и загрузите в него стволовые клетки опухоли головного мозга. Наконец, долгосрочная покадровая визуализация миграции стволовых клеток опухоли головного мозга осуществляется с помощью микроскопической системы «все в одном». В конечном счете, результаты показывают, что стволовые клетки опухоли головного мозга демонстрируют вращающуюся последовательность морфологических стадий во время их миграции через ультраограниченное пространство.

Основным преимуществом этой методики по сравнению с существующими массами, такими как камера Трансвелла-Бойтона, является то, что микроустройства позволяют визуально наблюдать за процессом миграции, контролировать размещение клеток и точно доставлять факторы. Таким образом, технология micro foric обладает функциями надежного, эффективного и экономичного выбора и навигации по одной ячейке. Применение этого метода распространяется на терапию метастазирования и рецидива рака, поскольку анализ одиночных клеток с высокой миграцией может выявить потенциальные будущие химиотерапевтические мишени.

Хотя этот метод может дать представление о миграционном поведении раковой системы, он также может быть применен к другим системам, таким как эмбриональное развитие, иммунные реакции, заживление ран и регенерация органов. Начиная с клеточной суспензии БТСК производного невроса копья. Соберите элементы в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте их при 900 оборотах в минуту в течение пяти минут, но не быстрее.

Аспирируйте супер натин. Затем дайте нейросферам расслабиться, инкубируя их в 0,5 миллилитрах предварительно подогретого Аккутана в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации механически разрушьте клетки с помощью от 10 до 20 легких взмахов пипеткой P 100.

Затем добавьте 1,5 миллилитра среды для стволовых клеток для нейтрализации центрифуги Аккутан, клеточную суспензию при 1300 об/мин в течение пяти минут и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре среды стволовых клеток. Проверьте плотность клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте плотность до 20 000 клеток на микролитр. Чтобы приступить к изготовлению мастера SU eight, подготовьте две фотошаблоны с помощью Adobe Illustrator и прозрачной пленки для лазерной печати со встроенным Image Setter.

Фотошаблон первого слоя состоит из двух реперных маркеров и массива микроканалов, а второй слой фотошаблона имеет посадочную и приемную камеры. Очистите оба слоя маски изопропанолом и дайте им высохнуть на воздухе. Теперь открутите ручку с фоторезистом SU eight толщиной три микрона, после чего последует мягкая выпечка.

Затем с помощью первого слоя фотомаски в плотном контакте с ультрафиолетом экспонируйте фотографию, устойкните и дайте ей застыть. Затем выпекайте после выпечки и проявите затвердевшую. Заклейте участки реперного маркера ручки скотчем.

Затем покройте пластину фоторезистом толщиной 250 микрон. После этого снимите ленту, чтобы показать маркеры для выравнивания. Поместите второй слой фоторезиста и выровняйте реперные маркеры.

Затем ультрафиолетовое воздействие экспонирует и отверждает второй слой фотомаски, после чего следует запекание и проявка. Теперь оснастите мастер SU eight с помощью осаждения из паровой фазы для уменьшения липкости поверхности. Поместите пластины в влагопоглотитель с несколькими каплями раствора Tri Chloro под вакуум не менее чем на один час.

После этого мастер будет готов к использованию для формования PDMS с помощью мастера. Начните с тщательного смешивания предварительной полимерной основы с отверждением в соотношении 10 к одному. Затем поместите смесь в влагопоглотитель для вакуумной дегазации до тех пор, пока не исчезнут пузырьки воздуха.

Вылейте смесь на маску и снова дегазируйтесь. Если вводятся новые пузырьки воздуха, то отверждайте форму на ровной горячей плите в течение двух часов при температуре 90 градусов Цельсия. После того как он остынет до комнатной температуры, аккуратно отпустите штамп PDMS.

Таким образом, каналы для культивирования выгравированы в PDMS и готовы к сборке микрофлюидного устройства. Мастер многоразовый для формовки до тех пор, пока он не треснет или не изношен. Когда мастер станет липким, покрытие антис-стик можно нанести повторно.

Начните с создания входных и выходных отверстий в микрофлюидном устройстве с помощью штампа PDMS. Используя прокол биопсийного отверстия, очистите штамп PDMS, замочив его в 70% этаноле на 30 минут, а затем промыв его деионизированной водой в течение 10 минут. Стерилизовать и завершить реакции сшивания штампа PDMS путем автоклавирования.

Теперь положите клеймо PDMS на стеклянную крышку, покрытую поли-L лизином. Затем устройство покрывают ламинатом путем заполнения камер раствором ламината через входные отверстия резервуаров и инкубируют в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день отсасывайте ламинат из аппарата.

Затем промойте устройство, дважды залив его средой для стволовых клеток. Теперь загрузите 11 микролитров диссоциированных клеток в один из резервуаров для посева При необходимости используйте вакуумную аспирацию, чтобы принудить клетки в камеру. Затем загрузите дополнительные семь микролитров ячеек в прилегающий резервуар для сидения.

Через пять минут посадочный и приемный резервуары будут заполнены фильтрующим материалом. Теперь поместите на устройство стерильный лист PDMS толщиной от 0,5 до одного миллиметра. Естественная адгезия PDMS к самой себе запечатает устройство после того, как оно будет запечатано, оно будет готово к транспортировке, инкубации и микроскопической визуализации.

Предварительно уравновесьте био, IM, запустив его в течение 45 минут. Чтобы стабилизировать его температуру, подачу влаги и воздуха, добавьте несколько чашек воды в камеру для образцов для получения необходимой влажности. Загрузите подготовленный прибор в камеру для образцов микроскопа.

Центрируйте устройство с помощью микропинцета. Теперь установите точки положения фокусировки и временные точки с помощью программного обеспечения Biot и при необходимости начните покадровую съемку. После пяти дней в культуре замените питательные среды.

BTC, засеянные в устройстве, непрерывно регистрировались с помощью фазового изображения. В течение пяти дней в камере для сидения веретенообразные клетки оставались в стадии до миграции. По мере приближения к входу в микроканал несколько клеток расширялись и образовывали адгезивные выступы.

Только одна клетка смогла занять вход и исследовать направление миграции. Как только клетка определяла направление миграции, она продолжала путешествовать по всему микроканалу с постоянно высокой скоростью. В конце микроканала клетка приступала к исследованию открытого пространства приемной камеры, прежде чем окончательно войти в нее.

Наблюдая за клетками с двухсекундными интервалами визуализации, миграционная энергия, по-видимому, генерируется в основном за счет активности болтовни, аналогичной активности OID-клеток. При проведении процедуры важно помнить, что конструкция устройства настолько гибкая, что размерами микроканалов можно манипулировать для достижения желаемой степени миграции клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать уникальное компартментализирующее микрофлюидное устройство, подходящее для культивирования интересующих вас клеток, а затем выполнить долгосрочную покадровую визуализацию для качественного и количественного определения миграционных характеристик этих клеток после этой процедуры.

Другие методы, такие как секвенирование нового поколения или микрочип ДНК, могут быть применены для ответа на дополнительные вопросы, например, насколько генетически отличаются высокомигрирующие раковые клетки.