Оценка подвижности нейронных стволовых клеток Использование агарозном геле основе микрожидкостных устройств

Привет, я Кевин Вон. Я учусь в магистратуре по специальности «Инженерия» в Лаборатории биожидкостей в Корнельском университете. Сегодня я расскажу об использовании микрофлюидного устройства на основе агроса для изучения влияния эпидермального фактора роста EGF на нейростволовые клетки Морин.

Устройство в основном состоит из трех микрофлюидных каналов, каждый шириной 150 микрон. ЭФР закачивается в один из боковых каналов, а буфер закачивается в другой боковой канал. По сути, он устанавливает статический линейный химический градиент через центральный канал.

Поскольку диффузный EGF легко диффундирует через агрогель, стволовые клетки нейронов засеваются в центральный канал и за ходом их миграции следят с помощью микроскопа. Таким образом, устройства в основном состоят из верхнего слоя из оргстекла, который имеет все входы и выходы для подключения к трубке. А под ней находится агрогелевая мембрана, в которой есть четыре устройства с рисунком.

Он окружен распоркой PDMS, что гарантирует постоянную толщину по всему устройству. PDMS и гель собираются на предметном стекле, которое покрыто и т.д. Это помогает клеткам прилипать к предметному стеклу.

Кроме того, пластина из нержавеющей стали используется для крепления всего устройства, и мы скрепляем устройство винтами. Клеточную линию дикого типа трансфицировали ретровирусным вектором для сверхэкспрессии рецептора EGF дикого типа, а дельта-клеточную линию трансфицировали мутированной версией рецептора EGF, что позволяет ей быть конституентно активными без лиганда EGF. Итак, я начну с объяснения процесса сборки нашего микрофлюидного устройства.

Поэтому я сначала разместил распорку PDMS вокруг рельефных элементов кремниевых микроканалов в наших мастерах. Итак, теперь я собираюсь взвесить 0,3 грамма агроса. Так что теперь я собираюсь поднять 10 миллионов независимых СМИ по CO2 и добавить их к агро.

И я собираюсь пипетировать вверх и вниз, чтобы смешать порошок aros с CO2-независимой средой. Теперь мы готовы к микроволновой печи. Как вы можете видеть сейчас, агрос теперь разжижен, но осталось еще несколько гранул.

Я попробую закрутить его вокруг, чтобы растворить гранулы и избавиться от пузырьков воздуха. Итак, я выливаю расплавленный агрос на рельефные элементы силиконового мастера, а теперь беру стерильное стекло и помещаю его на прокладку PDMS. И я ставлю его под углом, чтобы попытаться вытеснить большую часть пузырьков воздуха в агрогеле.

И я надавил и буду продолжать давить, пока оболочка агроса не затвердеет. Таким образом, через одну-две минуты он застывает. Теперь я уберу лишние агро с горки.

Следующим шагом будет осторожное снятие предметного стекла со стеклянного предметного стекла и установка на него может быть утилизирована. Теперь я попробую аккуратно перенести узор арос на предметное стекло, которое я ранее покрыла фибронектином. В основном я использую этот пластиковый стерильный лист, чтобы помочь мне снять шаблон agros с помощью проставки PDMM MS, и я передаю шаблон agros каналами вниз к слайду.

Теперь, когда он прочно закреплен на предметном стекле, я проделаю отверстия в отдельных резервуарах, чтобы пластиковый коллектор имел доступ к каналам. Я сделаю это с помощью небольшого дырокола для металла. Теперь мы закончили пробивать отверстия в устройстве.

Я добавлю 500 микролитров CO2-независимой среды, чтобы предотвратить высыхание микроканалов, и теперь я оставлю его на одну-две минуты. Хорошо, через одну-две минуты я попробую слить лишнюю среду и теперь выровняю отверстия, которые были пробиты в шаблоне agros, с входными и выходными отверстиями коллектора из плексигласа. И как только отверстия будут выровнены, я сильно нажимаю, чтобы сформировать красивое уплотнение.

Теперь я помещаю коллектор из плексигласа на крепления из нержавеющей стали и теперь аккуратно соединяю устройство с помощью винтов. Я очень осторожен, чтобы не перетянуть винты, потому что это приведет к сплющиванию каналов, и я вставляю винты по часовой стрелке, чтобы предотвратить образование пазов внутри геля Agros. Я собираюсь нарисовать один мил носителя и использовать этот шприц для тестирования устройства.

И, как вы можете видеть, я впрыскиваю жидкость в каждый микроканал и ищу, чтобы жидкость вышла из каждого выхода. Итак, прямо сейчас я поместил собранное устройство в климатическую камеру микроскопа. Она поддерживается на уровне 37 градусов по Цельсию, так что это прогреет устройство и подготовит его к тому моменту, когда нам нужно будет засеять клетки.

И, как вы можете видеть, я уже продел эти два, трубку насоса с зонтиком через установку. И в настоящее время я промываю трубки PBS в рамках подготовки к нашим экспериментам. Итак, теперь мы собираемся установить трубки.

Я собираюсь продеть трубку насоса зонтика через крышки с уже пробитыми в них отверстиями. И на каждой трубке есть определенное количество выемок, чтобы я мог определить как вход, так и выход трубки. Таким образом, трубка с четырьмя насечками на ней будет получать 10 нанограмм на мил.

Теперь решение EGF прикрепит трубку к устройству. Поэтому я прикреплю его к каждому устройству в зависимости от того, сколько у него выемок. Таким образом, это соответствует решению, которое он принимает.

А теперь прикрепляю выходную трубку. Мы используем прозрачную трубку Tigon, чтобы убедиться, что среда действительно проходит через выпускную трубку и в канале нет засоров. А теперь я запущу насосы зонтика.

Итак, теперь я начну процедуру засеивания ячеек в центральный канал. Я начну с удаления лишних медиа в сенсорном канале. Итак, теперь я увижу клетки.

Элементы уже находятся во взвешенном состоянии в CO2-независимых средах. И мне продали, меня посадили на 60 на входе центрального канала и мне посадили на 20 микролитров на выходе. И, надеюсь, клетки будут сидеть под действием гравитационного потока.

И я повторю эту процедуру для двух других чувствительных каналов, и теперь мы будем наблюдать за этим под микроскопом, чтобы увидеть, была ли успешная посадка клеток. Итак, теперь клетки прилипли к предметному стеклу и через несколько минут они начнут распространяться и приобретут свою уникальную морфологию. Итак, сегодня мы рассмотрели сборку самого устройства, подготовку реагентов и методы микроскопа, которые я использую для визуализации миграции клеток внутри устройства.

В заключение, мы надеемся, что это устройство будет иметь гораздо более широкое отречение, особенно в клинических условиях. Итак, рисуйте один горизонтально. На нем показаны траектории клеток C 17.2 и возрастающие концентрации EGF по вертикали.

Он показывает траектории различных штаммов клеток C 17.2, которые мы использовали в наших экспериментах с одинаковой концентрацией EGF. Данные родительских клеток показывают, что существует пик подвижности при градиенте концентрации EGF в 10 нанограмм на милль, что указывает на то, что рецепторы стали насыщены лигандом при более высокой концентрации EGF. Данные дикого типа показывают, что наблюдается увеличение подвижности при концентрации в 100 нанограммов на миль или EGF.

Это указывает на то, что рецепторы не насыщаются при более высоких концентрациях EGF. Это имеет смысл, поскольку они были разработаны для сверхэкспрессии рецептора EGF. Наконец, данные дельта-клеточной линии указывают на то, что подвижность клеток примерно не зависит от концентрации EGF.

Это также ожидаемо, поскольку мутировавшие рецепторы EGF были спроектированы таким образом, чтобы активироваться независимо от присутствия EGF.