Настраиваемая камера для измерительной ячейки миграции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы обеспечить простой способ изучения влияния хемотактических и хемопульсивных агентов на миграцию клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного взаимодействия, такие как влияние различных факторов роста на заживление ран. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она легко настраивается для различных приложений и проста в использовании для исследователей любого уровня квалификации.

Демонстрировать процедуру будут Аника Чоудхури, студентка бакалавриата, и Тайлер Харви, аспирант из моей лаборатории. Для начала создайте файл САПР с желаемой формой микроканала. Отрегулируйте ширину и длину канала, чтобы добиться требуемого градиента.

Здесь квадраты длиной 2,254 сантиметра соединены каналом шириной 0,127 сантиметра. Далее приобретите кусок акрила нужной толщины для того, чтобы создать надлежащую глубину микроканала. Ширина акрилового листа составляет около одной шестнадцатой дюйма, так как более толстые листы трудно резать, а очень тонкие листы могут сломаться или деформироваться во время процесса.

Импортируйте файл CAD в аппарат для лазерной резки и поместите акриловую деталь на режущую поверхность. Затем вырезаем патронник, согласно протоколу производителя. Поместите свежесрезанный акриловый вырез в форме штанги в маленькую чашку Петри и накройте ее до тех пор, пока она не понадобится.

В лодку для взвешивания добавьте десять частей эластомерной основы с одной частью отвердителя и перемешивайте с помощью микропипетки в течение пяти минут. Перенесите смесь в вакуумную камеру и потяните вакуум на 30 минут, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха из PDMS. Когда закончите, выключите пылесос и снимите весовую лодку.

Высыпьте дегазированный PDMS поверх акрилового выреза в форме штанги в небольшой чашке Петри. Убедитесь, что PDMS полностью покрывает вкладыш. Дайте PDMS затвердеть не менее 18 часов при комнатной температуре, затем осторожно разрежьте PDMS вокруг акрилового изделия скальпелем и снимите вкладыш.

В стандартном шкафу для клеточных культур поместите микроканальную камеру в чашку Петри лицевой стороной вверх и полностью покройте ее 70% этанолом. Затем закройте вытяжку и включите ультрафиолетовый свет. Подвергайте камеру воздействию ультрафиолетового излучения в течение одного-двух часов.

После воздействия откройте ламинарный колпак и подождите 15 минут, пока проточный колпак восстановит поток. Далее удалите 70% этанол и дважды промойте камеры стерильным PBS. Используйте один миллилитр PBS для каждой стирки.

После окончательной промывки снимите PBS и дайте камерам высохнуть в течение ночи со снятыми крышками. Соберите тип клеток, подлежащих тестированию, добавьте 100 микролитров клеточной суспензии к 400 микролитрам 0,4%-ного трипанового синего и аккуратно перемешайте. Нанесите на гемоцитометр 100 микролитров этого раствора, аккуратно заполнив обе камеры под стекло покровным стеклом.

Используйте микроскоп с 10-кратным объективом, чтобы сфокусироваться на сетке на гемоцитометре. Затем используйте ручной счетчик для подсчета живых, неустойчивых клеток во всех четырех наборах из 16 квадратов на гемоцитометре. Разделите общее число клеток на четыре и умножьте это число на 50 000, чтобы получить количество клеток на миллилитр клеточной суспензии.

Исходя из этого расчета, добавьте по 2500 ячеек и по 100 микролитров среды в одну лунку в каждой камере. Дайте клеткам постоять в камере в течение 60 минут, затем добавьте дополнительные среды. Для начала добавьте агарозу в воду и нагревайте раствор в микроволновке в течение одной минуты, или пока агароза полностью не растворится и раствор не станет прозрачным.

Дайте раствору остыть в течение 15-30 секунд, прежде чем вылить в чашку Петри. Чтобы удалить пузырьки, поместите чашку Петри в вакуумную камеру и дайте агарозе застыть, находясь под вакуумом в течение 30 минут. После застывания, вырежьте скальпелем из чашки Петри кубик агарозы размером два миллиметра на два миллиметра на два миллиметра.

Полностью погрузите кубик в раствор, содержащий желаемую концентрацию тактического фактора химиотерапии, и замочите агарозный блок на ночь при комнатной температуре. Затем поместите агарозный блок, содержащий фактор химиотерапии, в дальний конец микроканальной камеры. Используйте маркер, например, микрогранулы полистирола или микроскопический дефект в камере.

Для определения относительного начального расположения клеток. Используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы получать покадровые изображения движущегося фронта клеток каждый час в течение 12 часов. Серия изображений, показанная здесь, документирует движение клеточного фронта через канал в ответ на градиент эмбриональной бычьей сыворотки, размещенной на противоположном конце канала.

Расстояние миграции измеряли на основе расстояния фронта роста от микроскопического дефекта в устройстве. В результате этих измерений было обнаружено, что средняя скорость фронта клетки составляет 13,4 микрометра в час. После освоения эта техника может быть завершена за четыре часа, с дополнительными 18 часами ожидания для отверждения PDMS и дополнительными 12 часами для покадровой визуализации.

После своего развития этот метод проложил путь для исследователей с разным уровнем квалификации, в том числе для студентов бакалавриата с небольшим лабораторным опытом, чтобы легко исследовать заживление ран и миграцию клеток in vitro. При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать осторожно извлекать акриловую вставку из пресс-формы PDMS, чтобы обеспечить успешное изготовление микроканальной камеры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготовить простую микроканальную камеру для изучения миграции клеток в ответ на различные химические сигналы.

После этой процедуры можно изучить другие сигналы, такие как множественные растворимые химические градиенты, субстраты, прозрачные жидкости и электрические поля, чтобы изучить их влияние на миграцию клеток. Не забывайте, что работа с лазерными резаками может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как получение надлежащей подготовки и использование средств индивидуальной защиты.