Оценка вторжения клеток и процесс миграции: сравнение видео на базе микроскопа нуля раны пробирного и пробирной палаты Бойдена

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы представить и сравнить два анализа, используемых для изучения инвазии и миграции клеток: анализ в камере Бойдена и оптимизированный анализ царапин раны на основе видеомикроскопа in vitro. Эти эксперименты могут помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения инвазий и миграций, такие как выбор наиболее релевантного метода. Основное преимущество этого оптимизированного анализа царапин на основе видеомикроскопии in vitro заключается в том, что он обеспечивает воспроизводимое и точное сравнение условий лечения.

Хотя этот метод позволяет оценить миграцию и инвазию клеток, он также может быть применен в других областях исследования, таких как заживление или регенерация тканей. Подготовьте клетки SQ20B за 72 часа до первого дня анализа путем посева в два раза по 10 к 1/6 клеток в 25 миллилитров питательной среды в колбе площадью 175 квадратных сантиметров. Дайте клеткам вырасти до 80% слияния клеток при температуре 37 градусов Цельсия.

В первый день после трипсинизации и подсчета клеток засейте клетки в колбу площадью 25 квадратных сантиметров с плотностью клеток шесть умножить на 10 до 1/5 клеток в три миллилитра питательной среды для каждого условия, подлежащего оценке. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день уморите клетки голодом, заменив среду в каждой колбе тремя миллилитрами среды с низким содержанием бычьей сыворотки

Заморите клетки в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Для проведения инвазионного анализа подготавливают камеры Бойдена с покрытием через 12 часов после начала клеточного голодания. Поместите каждую камеру Бойдена в пластину для компаньонов.

Добавьте по 500 микролитров среды камеры голодания в каждую камеру с покрытием. На следующий день, на третий день, используйте сопутствующую пластину для приготовления хемоаттрактанта. Заполните каждую лунку 24-луночного планшета-компаньона 750 микролитрами готовой среды с 10% FBS, гидрокортизоном, пенициллином и стрептомицином.

Перенесите верхнюю камеру в предварительно заполненную пластину-компаньон, стараясь не допустить образования пузырей. Для проведения инвазионного анализа осторожно удалите 450 микролитров питательной среды из каждой камеры Бойдена. После трипсинизации и подсчета истощенных клеток SQ20B засемените три раза по 10 до 1/4 клеток в 500 микролитров среды 0,1% BSA, дав окончательное разведение в шесть раз по 10 до 1/4 клеток на миллилитр.

Поместите камеру Бойдена в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 24 часа. На четвертый день снимите каждую вставку с пластины-компаньона и осторожно удалите ячейки из верхней камеры с помощью ватной палочки. Впоследствии закрепите и окрасите каждую вставку по отдельности для получения окраски May-Grunwald Giemsa с помощью набора для окрашивания в соответствии с инструкциями производителя.

Проведите микроскопический анализ на пятый день. Вставьте пластину-компаньон со вставками в 20-кратный фазово-контрастный микроскоп и подсчитайте каждую мигрировавшую клетку в нижней части мембраны. За 72 часа до первого дня анализ засеивают два раза по 10 до 1/6 клеток SQ20B в 25 миллилитров питательной среды в колбе площадью 175 квадратных сантиметров и позволяют клеткам вырасти до 80% слияния клеток.

В первый день после трипсинизации и подсчета клеток сгенерируйте предварительно разбавленный образец клеток SQ20B с плотностью от четырех до 10 до 1/5 клеток на миллилитр. Налейте по 100 микролитров клеточного раствора в каждую лунку 96-луночного планшета, чтобы получить конечную плотность в четыре раза по 10 до 1/4 клеток на 100 микролитров в каждой лунке. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и дайте ячейкам прилипнуть к пластине в течение 12-16 часов.

На следующий день отнести пластину к капюшону для нанесения раны с помощью коммерческого ранящего устройства. Снимите верхнюю часть раноприемника и установите его в раствор для промывки. Вставьте пластину в держатель опорной плиты и снимите крышку пластины.

Установите на место блок штифтов, направив задние дюбеля блока пальцев в задние отверстия опорной плиты. Нажмите и удерживайте черный рычаг и поднимите блок штифтов, продолжая удерживать черный рычаг вниз. С помощью пипетки с адаптированным коническим наконечником немедленно удалите среду из каждой лунки, стараясь не задеть рану.

Промойте клетки, добавив в каждую лунку по 100 микролитров клеточной среды, нагретой до 37 градусов Цельсия. После второго промывки с помощью пипетки с адаптированным коническим наконечником отсасывайте клеточную среду. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров среды, специфичной для каждого условия обработки, следя за тем, чтобы в лунках не образовывались пузырьки.

Поместите 96-луночный планшет в приспособленную стойку видеомикроскопа. С помощью программы видеомикроскопа график сканирования по одному снимку на лунку. Для эксперимента по миграционной инвазии требуется не более двух часов.

Если целью эксперимента является создание видео, предпочтительным является интервал не более 30 минут. Отслеживайте и проверяйте миграцию клеток в течение как минимум 24 часов и до пяти дней, используя соответствующую маску клеток, адаптированную для каждого типа клеток, чтобы проанализировать миграцию клеток. Чтобы получить маску клетки, адаптированную для каждой клеточной линии, сгенерируйте определение обработки клеток из программного обеспечения, используя определенную коллекцию изображений клеток.

Обведите кривые и экспортируйте данные в электронную таблицу, которую можно использовать для анализа и сравнения результатов. Для подготовки к анализу клеточной инвазии засейте клетки SQ20B таким же образом, как это продемонстрировано для анализа миграции клеток, и инкубируйте 96-луночный планшет в инкубаторе. На второй день анализа подготовьте внеклеточный матрикс.

Разморозьте матрицу при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем за 12 часов до использования и убедитесь, что не видно агрегатов. Охладите микроцентрифужные пробирки на льду в течение пяти минут. Разбавьте матрицу предварительно охлажденными до четырех градусов Цельсия коническими наконечниками в предварительно охлажденных микроцентрифужных пробирках с клеточной средой, охлажденной до четырех градусов Цельсия, до получения конечной концентрации 300 микрограмм на миллилитр.

Пробирки микроцентрифуги с предварительно разведенной матрицей храните в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия. Достаньте из инкубатора планшет на 96 лунок. Под капюшоном делают рану с помощью коммерческого ранящего устройства в соответствии с протоколом производителя, как было продемонстрировано ранее.

С помощью пипетки с адаптированным коническим наконечником немедленно удалите среду из каждой лунки и будьте осторожны, чтобы не задеть рану. Промойте клетки дважды, используя 100 микролитров клеточной среды, подогретой до 37 градусов Цельсия. После второй промывки поместите тарелку на лед на пять минут, чтобы уравновесить его температуру.

Удалите холодную среду из каждой лунки, стараясь осторожно проводить пипетку от края и не касаться раны. С помощью конических наконечников, предварительно охлажденных до четырех градусов Цельсия, добавьте в каждую лунку по 50 микролитров предварительно разведенной матрицы. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут.

Через 30 минут добавьте по 100 микролитров адаптированной клеточной среды в каждую лунку, как показано для каждого условия лечения. Поместите пластину в приспособленную стойку в видеомикроскоп. Затем запрограммируйте сканирование и выполните анализ видеомикроскопии, как показано для анализа миграции клеток.

Приведены репрезентативные результаты мембраны Бойдена после клеточной фиксации. Субоптимальная мембрана имеет клеточные кластеры на верхней стороне мембраны и неинтерпретируемые результаты. В отличие от этого, оптимальная мембрана имеет счетные клетки в нижней части мембраны, окрашенные в синий цвет.

Оптимальный результат анализа царапины на рану иллюстрируют эти изображения заживления раны в нулевой час, 15 часов и 30 часов. Критериями качественного эксперимента являются линейная рана, отсутствие фрагментов клеток в ране и оптимальное слияние клеток. 90%-ное слияние является оптимальной плотностью клеток для анализа заживления ран, как показано на панели А. На панели В показан пример низкой плотности клеток, а на панели В показаны кластеры клеток, вызванные недостаточной промывкой клеточной гранулы.

Это графическое представление заживления раны, полученное с помощью программного обеспечения видеомикроскопа, показывает количественную оценку параметров слияния раневых клеток по времени для четырех условий лечения. Было замечено, что комбинированное лечение значительно снижает миграцию клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценивать миграцию клеток и процесс инвазии.