Протоколы для Вагинальные Прививка и сбора проб в экспериментальной модели мышей Candida Вагинит

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы продемонстрировать специфические процедурные особенности, связанные с использованием экспериментальной модели вагинального кандидоза у животных для количественного определения грибковой нагрузки в влагалище, а также для использования вагинальных или лимфоидных клеток в специальных анализах, таких как иммунологические и гистологические исследования. Для этого сначала будет продемонстрирована техника вагинальной инокуляции у мышей, получавших эстроген. Затем, после эвтаназии мыши, будет проведен вагинальный лаваж для выделения Candida.

Затем извлекают ткани влагалища и/или регионарные лимфатические узлы влагалища. Жидкость для промывания можно исследовать микроскопически для обнаружения Candida, ассоциированной с эпителиальными клетками влагалища, или посеять на агар для количественной оценки грибковой нагрузки во влагалище. Мазок клеточной фракции также может быть использован для окрашивания на эпителиальные и лимфоидные клетки.

Основное преимущество демонстрации данной методики заключается в том, чтобы пользователи животной модели вагинита могли применять ее максимально эффективно и результативно. С помощью данной методики в области изучения вагинита и экологии микробиома решаются такие ключевые вопросы, как иммунный ответ хозяина, клеточное распределение, эффективность лекарственных препаратов, эффективность иммунотерапии, а также воздействие иммунизации. Сегодня аспирант моей лаборатории, Джунко Яно, продемонстрирует технику инфицирования мыши *C. albicans* через три дня после введения бета-эстрадиола.

Начните со стабилизации мыши на плоской поверхности gRED, чтобы животное могло за нее зацепиться. Затем удерживайте основание хвоста двумя пальцами и приподнимите таз так, чтобы отверстие влагалища было обращено к вам. Введите наконечник пипетки примерно на пять миллиметров в просвет влагалища и наберите до 20 µL суспензии инокулята.

Выполните этот этап как можно быстрее и осторожнее, чтобы минимизировать стресс у мыши. По истечении необходимого периода инкубации подвергните животное эвтаназии в соответствии с протоколом вашего учреждения. Затем двумя пальцами зафиксируйте мышь, удерживая ее за основание хвоста вниз головой, чтобы обеспечить доступ к отверстию влагалища для использования пипетки.

Введите 100 µL стерильного PBS в просвет влагалища, затем проведите промывание, используя повторные аспирации и перемешивания. Если наконечник пипетки забьется клетками, удалите обструкцию и продолжите промывание оставшимся объемом PBS. Соберите жидкость для промывания в микроцентрифужную пробирку.

После процедуры промывания влагалища положите мышь на спину и смочите область паха 70% ethanol. С помощью пинцета приподнимите мочевыводящее отверстие так, чтобы стало видно вход во влагалище. Введите изогнутый пинец в просвет влагалища и найдите шейку матки, надежно удерживая её пинцетом.

Извлеките шейку матки через влагалищную полость, иссеките влагалище у основания влагалищного отверстия, а затем удалите шейку матки из влагалища с помощью хирургических ножниц. Поскольку ткани влагалища инволютированы, выверните их, чтобы сохранить исходную ориентацию, или рассеките их вдоль, превратив в плоский лист, сделав латеральный разрез для иссечения поясничных лимфатических узлов, расположив животное на спине. Пропитайте брюшную полость 70% ethanol.

Сделайте латеральный разрез от нижней части брюшной полости до грудной клетки и обнажите внутренние органы, используя пинцеты в обеих руках. Сместите кишечник вверх, чтобы стали видны центральные кровеносные сосуды. Найдите нижнюю полую вену и брюшную аорту.

Пару поясничных лимфатических узлов можно обнаружить рядом с брюшной аортой, примерно на полпути между отхождениями почечных и общих подвздошных артерий. Эти лимфатические узлы визуально отличаются от жировой ткани своей эластичной текстурой, а также более светлым и матовым цветом. Кроме того, у инфицированных животных они заметно больше, чем у неинокулированных.

У животных извлекают лимфатические узлы, помещая микропинцет под узел, а затем осторожно потягивают его вверх, чтобы отделить от окружающих тканей. После извлечения тканей перенесите лимфатические узлы на стерильный проволочный сетчатый экран, помещенный в стерильную стеклянную чашку Петри, содержащую около 10 milliliters сбалансированного солевого раствора Хэнкса. Для изоляции лимфоидных клеток обратитесь к письменному протоколу.

Клеточные фракции жидкости при промывании влагалища мышей, инокулированных не менее чем за четыре дня до этого, обычно состоят из эпителиальных клеток влагалища и клеточных инфильтратов, что показано здесь при микроскопии в «жидкой капле». Candida можно идентифицировать по наличию псевдогиф, а также дрожжевых клеток. Здесь представлены окрашенные мазки-отпечатки жидкости при промывании влагалища.

Использование метода мазка Папаниколау для исследования эпителиальных клеток и инфильтрующих лейкоцитов, основными из которых являются нейтрофилы, что можно определить по характерным сегментированным ядрам. У неинфицированных мышей нейтрофилы обнаруживаются крайне редко или отсутствуют. На данном рисунке представлен пример грибковой нагрузки в влагалище.

Жидкость при промывании влагалища собирают в определенные моменты времени и культивируют для подсчета КОЕ. В данном примере жидкость собирали на пятый день после инокуляции, подвергали серийному разведению, высевали на чашки и инкубировали в течение 48 часов. Затем подсчитывают количество колоний и рассчитывают грибковую нагрузку во влагалище; колонизация влагалища или инфекция Candida сохраняется в течение нескольких недель у инокулированных мышей, получавших эстроген.

В то время как Candida не удается установить колонизацию влагалища у инокулированных мышей, не получавших эстроген, у неинокулированных мышей, получавших эстроген, на протяжении всего времени Candida не обнаруживается. Кроме того, промывание влагалища можно проводить либо однократно на разных мышах в каждой временной точке, либо лонгитюдно у одних и тех же мышей под анестезией. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости надежной фиксации животных во избежание травм влагалища, а также уделить достаточное время тщательному промыванию для получения точных данных о грибковой нагрузке во влагалище при последующем извлечении тканей влагалища.

Используйте неподвижный PBS, чтобы предотвратить их дегидратацию; пожалуйста, будьте осторожны, чтобы не повредить основные вены и артерии при удалении лимфатических узлов. При обработке клеток лимфатических узлов держите их на льду или при температуре 4 °C для сохранения жизнеспособности клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать экспериментальную модель кандидозного вагинита у мышей для воспроизводимой количественной оценки грибковой нагрузки во влагалище и выделения тканей влагалища или лимфоидных тканей для проведения специфических иммунологических или гистологических анализов.