Протоколы для Вагинальные Прививка и сбора проб в экспериментальной модели мышей Candida Вагинит

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать конкретные процедурные вопросы, связанные с использованием экспериментальной модели вагинального кандидоза на животных в качестве средства количественной оценки вагинальной грибковой нагрузки, а также использовать вагинальные или лимфоидные клетки в специфических анализах, таких как иммунологические и гистологические анализы. Это будет достигнуто путем демонстрации техники вагинальной инокуляции на мышах, получавших эстроген. Далее, после усыпления мыши, будет проведен вагинальный лаваж для восстановления кандида.

Затем будет удалена ткань влагалища и/или вагинальные дренирующие лимфатические узлы. Жидкость для лаважа можно рассмотреть под микроскопом, чтобы выявить кандиду, связанную с эпителиальными клетками влагалища, или нанести на агар для количественной оценки вагинальной грибковой нагрузки. Мазок клеточной фракции также может быть использован для окрашивания эпителиальных клеток и лимфоидных клеток.

Таким образом, основное преимущество демонстрации этой методики заключается в том, что пользователи животной модели вагинита могут сделать это наиболее эффективно и результативно. Ключевые вопросы, на которые мы получаем ответы с помощью этой техники, относятся к области вагинита и экологии и отвечают на такие ключевые вопросы, как иммунные реакции хозяина, клеточное распределение, эффективность лекарств, иммунотерапевтическая эффективность, а также эффекты иммунизации и демонстрации техники. Сегодня будет аспирант в моей лаборатории, junco yano, чтобы заразить мышь C. albicans через три дня после введения инъекции бета-эстрадиола.

Начните с стабилизации мыши на плоской поверхности gRED, чтобы она могла держаться. Затем возьмитесь за основание хвоста двумя пальцами и поднимите бедро вверх так, чтобы вход во влагалище был обращен к вам. Введите наконечник пипетки примерно на пять миллиметров вглубь просвета влагалища и нанесите пипеткой до 20 микролитров суспензии инокулюма.

Выполните этот шаг как можно быстрее и аккуратнее, чтобы свести к минимуму стресс у мыши. После желаемого инкубационного периода усыпьте животное в соответствии с протоколом вашего предприятия. Затем двумя пальцами удерживайте мышь вниз за основание хвоста так, чтобы вход во влагалище обнажил пипеткой.

Ввести в просвет влагалища 100 мкл стерильного ПБС, и при повторной аспирации и возбуждении провести промывание. Если наконечник пипетки засоряется клетками, удалите обструктивные клетки и продолжайте разрушать оставшийся PBS. Соберите жидкость для промывания в микроцентрифужную пробирку.

После процедуры промывания влагалища положите мышь на спину и пропитайте область паха 70% этанолом. С помощью щипцов поднимите мочевое отверстие вверх так, чтобы отверстие во влагалище стало открытым. Вставьте пару изогнутых щипцов в просвет влагалища и найдите шейку матки, сохраняя крепкий захват щипцами.

Извлеките шейку матки через полость влагалища, иссеките влагалище у основания входа во влагалище, а затем удалите шейку матки из влагалища хирургическими ножницами. Поскольку ткань влагалища инволютирована, переверните ее, чтобы сохранить первоначальную ориентацию, или откройте лист, сделав боковой разрез для иссечения поясничного узла с животным на спине. Насытите брюшную полость 70%-ным этанолом.

Сделайте боковой разрез, начиная от нижней части живота до груди, и обнажите внутренние органы с помощью пары щипцов в обеих руках. Переместите кишечник вверх так, чтобы стали видны центральные кровеносные сосуды. Найдите нижнюю полую вену и брюшную аорту.

Пара поясничных лимфатических узлов может быть идентифицирована, примыкающая к брюшной аорте, расположенная примерно на полпути между началом почечной и общей подвздошной артерией. Эти лимфатические узлы можно визуально отличить от жировой ткани по их эластичной текстуре, они более светлые и непрозрачные по цвету по сравнению с жировой тканью. Они также заметно больше у инфицированных животных по сравнению с непривитыми.

Животные иссекали лимфатические узлы, помещая микрощипцы под узел, а затем осторожно подтягивали вверх, чтобы отделить их от окружающих тканей. После иссечения ткани лимфатические узлы переносятся на стерильный сетчатый экран, помещенный внутрь стерильной стеклянной чашки Петри, содержащей около 10 миллилитров сбалансированного раствора соли Хэнка. Чтобы выделить лимфоидные клетки, обратитесь к письменному протоколу.

Клеточные фракции жидкости для промывания влагалища у мышей, инокулированных не менее чем за четыре дня до этого, обычно состоят из эпителиальных клеток Candida и клеточных инфильтратов, как показано здесь с помощью микроскопии влажного монтирования. Кандиду можно определить по присутствию PHA, а также дрожжей. Здесь мазают препаратами жидкости для промывания влагалища.

Использование метода мазка Папаниколау для исследования эпителиальных клеток и инфильтрирующих лейкоцитов, основными клетками которых являются нейтрофилы, которые можно идентифицировать по трарктическим долям. Очень мало нейтрофилов, если таковые имеются, обнаруживается у непривитых мышей. На этом рисунке показан пример грибковой нагрузки на влагалище.

Жидкость для лаважа влагалища собирают в определенные моменты времени и культивируют для подсчета КОЕ. В этом примере жидкость собирали на пятый день после инокуляции, серийно, разбавляли и инкубировали в течение 48 часов. Затем подсчитывают колонии и рассчитывают вагинальную грибковую нагрузку. Вагинальная колонизация или инфекция кандидозом сохраняется в течение нескольких недель у привитых мышей, получавших эстроген.

В то время как кандида не может установить вагинальную колонизацию у инокулированных мышей, не получавших эстроген, неинокулированные мыши, получавшие эстроген, оставались отрицательными на кандиду в течение всего времени. Кроме того, вагинальные промажи могут быть выполнены либо один раз на отдельных мышах в каждый момент времени, либо продольно на одних и тех же мышах под анестезией. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о надежном удержании животных, чтобы избежать травмирования влагалища, и, пожалуйста, уделите время, необходимое для тщательного промывания для получения точной вагинальной грибковой нагрузки при извлечении вагинальных тканей.

Используйте неподвижные PBS, чтобы предотвратить обезвоживание, и, пожалуйста, будьте осторожны, чтобы не повредить крупные вены и артерии при удалении лимфатических узлов, а при обработке клеток лимфатических узлов держите их на льду или при температуре четыре градуса для поддержания жизнеспособности клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как использовать экспериментальную мышиную модель кандидозного вагинита для воспроизводимой количественной оценки вагинальной грибковой нагрузки и иссечения вагинальных или лимфоидных тканей для специфических иммунологических или гистологических анализов.