Функциональной визуализации кальция в развивающихся Корковая сетей

Общая цель этого фильма — продемонстрировать, как измерить сетевую активность от развития корковых срезов мозга с помощью чувствительного к кальцию флуоресцентного индикатора. Срезы мозга DY делаются из развивающейся энтеральной коры молодой мыши. Как нейроны, так и астроциты загружены кальцийзависимыми маркерами.

Изменения флуоресценции кальций-зависимых красителей отражают изменения клеточной активности. Ненейрональные клетки, включая астроциты, микроглию и эндотелиальные клетки, могут быть окрашены с помощью специальных маркерных красителей. Активность корковой сети записывается с помощью покадровой съемки Многофотонные ячейки обнаруживаются внутри сети путем создания 3D-стека изображений через интересующую область.

Изменения клеточной флуоресценции в нескольких клетках могут быть затем проанализированы, чтобы определить активность развивающейся корковой сети. Отличительной чертой активности развивающейся нервной системы является спонтанная синхронизированная сетевая активность. Синхронизированная активность наблюдалась во многих различных развивающихся областях нейронов, включая интактную кору спинного мозга и препараты культуры диссоциированных нейронов в периоды спонтанной активности нейронов, деполяризованных до возбуждения, одиночных всплесков или вспышек потенциалов действия, активирующих многие железные каналы, включая потенциал-зависимые кальциевые каналы, приводящие к притоку кальция.

Высокосинхронизированная активность была измерена в локальных сетях с использованием полевых электродов или многоэлектродных матриц. Они обеспечивают высокую частоту временной выборки, но дают более низкое пространственное разрешение благодаря встроенному считыванию активности клеток. Одноклеточное разрешение нейронной активности возможно с помощью электрофизиологии одиночных нейронов с помощью патч-хомута для измерения скоростей возбуждения.

Тем не менее, возможность измерения по сети ограничена числом нейронов, подключенных одновременно, и, как правило, составляет только один или два нейрона. Использование кальций-зависимых флуоресцентных индикаторных красителей позволило измерить синхронизированную активность в сети клеток. Этот метод обеспечивает как высокое пространственное разрешение, так и достаточную временную выборку для регистрации спонтанной активности развивающейся сети.

Флуоресцентные кальциевые чувствительные индикаторы, такие как эфир URA 2:00 AM, содержат группы карбоновых кислот, которые способны связывать кальциевые мины. Эти флуоресцентные красители активируются определенными длинами световых волн с помощью однофотонной или двухфотонной микроскопии. Количество фотонов, испускаемых красителем, временно изменяется при связывании кальция.

Это изменение числа фотонов или флуоресценции сообщается как дельта-сигнал FF и соответствует изменению уровня кальция в нейроне. Измерение изменений чувствительных к кальцию показателей является полезным средством считывания паттернов активности сети в развивающихся клетках. Здравствуйте, меня зовут Рианна Морти, а зовут меня Джули Эбботс.

Мы работаем на кафедре интерпретативной нейрофизиологии и в университете в Амстердаме. Мы использовали визуализацию кальция для изучения функциональной активности в развивающихся тканях коры головного мозга мыши с использованием чувствительных к кальцию показателей при мультифокальной визуализации. Цель этого короткометражного фильма — продемонстрировать, как эти методы могут быть использованы для измерения как спонтанных, так и вызывающих паттернов активности в развивающихся сетях нервной системы.

Быстро удалите мозг из черепа молодой мыши, чтобы уменьшить повреждение нейронных цепей. Препарируйте мозг в ледяном растворе для срезов. Раствор среза содержит хлорид колина вместо натрия, обычно используемого в A TSF для нейронных записей.

В этих экспериментах мы делаем срезы мозга из энтеральной коры развивающегося мозга мыши. Положите лист фильтровальной бумаги на верхнюю часть петро-тарелки и смочите его несколькими миллилитрами TSF. Перенесите мозг на лист фильтровальной бумаги.

Разделите полусферы пополам с помощью лезвия бритвы с одной кромкой. Разделите два полушария. Поместите одну обратно в ледяной раствор с оставшимся полушарием.

Удалите мозжечок лезвием бритвы. Переверните одно полушарие на его среднюю линию, и сделайте надрез примерно в одном миллиметре от дорсальной поверхности с небольшим углом лезвия в сторону рострального конца. Включите мозг.

Его недавно вырезанная поверхность с помощью хлопчатобумажной птицы и металлического шпателя. Перенесите мозг на металлорежущий блок. Аккуратно вытолкните мозг из шпателя с помощью ватной пюрочки на приклеенную поверхность.

Для молодых тканей разрезаются срезы мозга размером 300 микрометров, скорость резки и частота лезвия, как правило, ниже, чем у более зрелых тканей. После разрезания каждый ломтик переносят с помощью стеклянной пипетки, срезы которого переносят в камеру хранения, которая содержит насыщенный кислородом А TSF при комнатной температуре. A CSF содержит более высокое соотношение магния и кальция, чем раствор A CSF.

Используемые для записи слайсы оставляют на один час для восстановления. Чтобы загрузить клетки кальцийзависимым индикатором или специфическим для клеток маркером, срезы необходимо перенести в камеру для процедуры окрашивания. Несмотря на то, что существуют коммерческие камеры, одна из них может быть легко собрана из стандартного лабораторного оборудования за очень небольшую плату.

Чтобы сделать камеру для окрашивания, вам понадобится следующее базовое лабораторное оборудование: две пластиковые чашки Петри, один 10-миллилитровый шприц, секция силиковой трубки, вкладыш для клеточных культур с полупроницаемым мембранным суперклеем, три небольших соединителя трубок и тонкая игла. Возьмите большую чашку Петри и проделайте небольшое отверстие с помощью нагретого стержня через боковину. Возьмите маленькую чашку Петри и сделайте отверстие такого же диаметра, достаточное для того, чтобы через него могла пройти силиконовая трубка.

Пропустите секцию силиконовой трубки через отверстие и сформируйте петлю внутри маленькой чашки. Используйте суперклей для герметизации открытого конца трубки. Затем приклейте оставшуюся часть трубки к внутренней стенке маленькой чашки Петри.

Поместите маленькую чашку Петри в центр большой и приклейте на место. Возьмите оставшийся конец силиконовой трубки и пропустите его через небольшое отверстие в боковой стенке чашки Петри. Возьмите тонкую иглу и сделайте небольшие отверстия в силиконовой трубке внутри чашки Петри.

Сделайте отверстия через равные промежутки для равномерного сплавления газов. Хорошо возьмите культуру клеток с полупроницаемой мембраной с помощью нагретого скальпеля. Срежьте верхний один сантиметр лунки, чтобы оставить неглубокую посуду для хранения ломтиков во время инкубации.

Поместите неглубокую тарелку в центр небольшой тарелки, окруженной пористой силиконовой трубкой. Сделайте отверстие диаметром примерно от половины до одного сантиметра в крышке большого блюда. Возьмите пластиковый шприц объемом 10 миллилитров с помощью нагретого скальпеля.

Сделайте скошенный надрез, чтобы удалить конец шприца. Нанесите суперклей на поверхность среза тюбика шприца. Воткните его прямо над отверстием на большой крышке чашки Петри.

Прикрепите соединитель трубки к концу наконечника шприца. Поместите неглубокую чашу в центр небольшой чашки Петри, следя за тем, чтобы пористая газовая трубка лежала вокруг чашки. Затем эта трубка подключается к источнику газа карбоген для насыщения ломтиков кислородом.

Во время инкубации установите на место крышку большой чашки, которая также подключается непосредственно к подаче газа через наконечник шприца. Это приведет к притоку автомобиля и бензина на срезы во время инкубации, чтобы избежать обесцвечивания красителя. Все процедуры проводятся при минимальном освещении, а краситель и срезы хранятся в темноте.

Заполните камеру окрашивания примерно полутора миллилитрами A TSF из держателя для срезов. Поместите внутрь камеру сопряжения и заполните еще одним миллилитром A TSF. Важно поддерживать хорошее снабжение кислородом, чтобы сохранить ткань здоровой и обеспечить хорошую нагрузку на срез.

Окрашивание происходит при температуре около 35 градусов Цельсия, чтобы облегчить всасывание красителя в нейроны, пока камера для окрашивания нагревается. Приготовьте индикаторный краситель для fira 2:00 AM Ester. Добавьте девять микролитров ДМСО с одним микролитром ионовой кислоты во флакон объемом 50 микрограммов.

ДМСО и соновая кислота. Действуют как пермеагенты, позволяющие красителю проникать через липидную мембрану. Переведите флакон на 15 минут, чтобы убедиться, что краситель полностью растворился.

Для окрашивания перенесите каждый срез в интерфейс. Вставьте в камеру для окрашивания. Нанесите краситель непосредственно на интересующую область над срезами, закройте крышку камеры для окрашивания.

Оставьте ломтики инкубироваться в темноте на 20-40 минут в зависимости от возраста используемого мауса. После инкубации переложите ломтики обратно в держатель для ломтиков, чтобы смыть остатки красителя. Протоколы окрашивания для визуализации кальция также могут быть адаптированы для более старых тканей.

Для этого требуется дополнительный этап предварительной инкубации. Переложите старые ломтики в неглубокую прединкубационную чашку, наполненную тремя миллилитрами ликвора и восемью микролитрами раствора четырех пенок при 0,5% Нагрейте до 35 градусов С в течение трех минут. Затем перенесите срезы в интерфейс, вставьте в камеру окрашивания и следуйте обычным процедурам окрашивания.

Также можно окрашивать эти срезы для ненейрональных клеток, а именно астроцитов, микроглии и эндотелиальных клеток. Серный рубин 1 0 1 можно использовать для окрашивания астроцитов на домин серы. Сделайте раствор из 10 микромоляров пипеткой фиолетового красителя над интересующей областью в области срезов.

Оставьте для инкубации на 15 минут. Перенесите ломтики обратно в камеру выдержки, чтобы удалить излишки красителя. Конъюгат фсэс лектина томата может окрашивать микроглию и эндотелиальные клетки.

Для томатного лектина делают раствор 20 микрограмм на миллилитр. Нанесите краску на интересующую область на ломтиках. Оставьте ломтики инкубироваться на 45 минут.

Затем еще раз переложите ломтики обратно в камеру выдержки. Во время визуализации срезы должны быть стабильными под микроскопом. Обычно металлическая арфа помещается для удержания ткани, однако она может неравномерно деформировать поверхность среза, оставляя лишь ограниченное поле зрения в фокусе, чтобы избежать визуализации.

Эти срезы приклеиваются к записывающей камере с помощью раствора POLYETHALINE или PEI. PEI — это полимер, используемый для усиления прикрепления клеток к поверхности по крайней мере на один час. Прежде чем поместить срезы в записывающие камеры, заполните эти камеры несколькими миллилитрами раствора PEI, чтобы покрыть пол камеры.

Сначала промойте PEI из камеры дистиллированной водой, а затем переведите раствор CSF. Переложите срез в записывающую камеру и удалите излишки раствора A CSF. Расположите ломтик в центре камеры с помощью тонкой кисти.

Удалите всю дальнейшую спинномозговую жидкость с помощью небольших кусочков впитывающей фильтровальной бумаги. Следите за тем, чтобы по краям среза больше не было спинномозговой жидкости. Наконец, аккуратно нанесите полмиллилитра ликвора на ломтик, не отрывая его от камеры.

Поместите камеры в большой насыщенный кислородом контейнер для интерфейса и оставьте еще на один час в темноте. Изменения в чувствительных к кальцию индикаторных красителях могут быть зарегистрированы с помощью однофотонной или двухфотонной микроскопии. Мы используем титановый сапфировый лазер, соединенный с микроскопом Olympus, чтобы обеспечить двухфотонную визуализацию в наших нейронных сетях.

Кроме того, мы используем биотехнологическую систему триммеров L Vision с камерой MATSU с электромагнитной ПЗС-матрицей для увеличения скорости сканирования кадров. Поместите камеру для среза под микроскоп со стабильным потоком оксигенированного A-T-S-F-A-T-S-F, содержащего 1,6 миллимоляра кальция и 1,5 миллимолара. Магний нагревается примерно до 30 градусов Цельсия в установке с помощью белого света.

Найдите интересующую область на срезе и сфокусируйтесь на поверхности. Выключите свет и закройте дверцу записывающего шкафа. Для снижения уровня фонового освещения.

Для записи и анализа изображений доступно множество различных коммерческих или открытых пакетов программного обеспечения В нашей лаборатории мы используем программное обеспечение инспектора от Lavis Biotech. Чтобы начать съемку, выберите режим ПЗС-камеры для обнаружения. Установите длину волны, соответствующую вашему индикатору.

Для fira 2:00 AM Ester мы установили возбуждение на 820 нанометров в программном обеспечении триммера. Выберите режим сканирования 64 В. Выберите оптимальный размер, поле зрения и разрешение в пикселях для интересующей вас области.

Выберите подходящую частоту кадров и вращение пикселей, если это необходимо для выборки изображения. Откройте лазерный затвор, готовый к непрерывной съемке. Использование режима непрерывной визуализации.

Отрегулируйте усиление и интенсивность лазера и сфокусируйтесь на нейронной сети, которую вы хотите визуализировать. Остановите сканирование. Выберите настройки интервальной съемки для частоты кадров и длительности эпизода.

После цейтраферной съемки сделайте стек изображений Z, отметив 20 микрон вверху и 20 микрон ниже с шагом в один микрон. Этот Z-стек используется для обнаружения ячеек во время анализа. Экспортируйте записанные файлы в виде стопки изображений в формате TIFF.

В заключение мы показали использование показателей кальция для измерения синхронной спонтанной сетевой активности в развивающейся коре головного мозга. Более подробную информацию о методологии и реагентах можно найти в технических описаниях, прилагаемых к этой пленке, чтобы вы могли настроить эту технику в своей лаборатории.