Оценка изменения Печеночная Метаболический Во Прогрессивная Колонизация зародыш без мыши по ¹ Н-ЯМР-спектроскопии

Целью данной процедуры является оценка влияния прогрессирующей колонизации на метаболизм печени хозяина. Это достигается путем постепенной колонизации стерильных мышей. Процесс колонизации контролируется путем оценки экскреции микробных сометаболитов с мочой с помощью ЯМР-спектроскопии.

После мониторинга процесса колонизации у мыши берут биопсию печени и подготавливают к метаболическому профилированию. Затем метаболический профиль печени может быть получен из интактной биопсии с помощью неразрушающей ЯМР-спектроскопии с магическим углом вращения с высоким разрешением. В конечном счете, такое использование протонной ЯМР-спектроскопии выявляет различные метаболиты, участвующие в метаболических путях, таких как энергетические пути и пути окислительного стресса.

Таким образом, этот эксперимент может дать представление о функциях печени во время колонизации. Он также может быть применен через такую систему, как почка. Чтобы колонизировать животных, удалите стерильных мышей из изоляторов и поместите их в обычное помещение для содержания животных в клетках, оборудованных фильтром перед обычными животными, которые служат в качестве контрольных.

Затем смешайте половину трехдневного помета, взятого из контрольной обычной клетки, с подстилкой для стерильных животных, соберите мочу в микропробирку объемом 1,5 миллилитров, проведя мышью над трубкой, и помогите ей, мягко массируя кишечник. Минимум 20 микролитров требуется для получения данных с помощью пятимиллиметрового ЯМР-зонда, но рекомендуется использовать 30 микролитров для улучшения качества метаболического профилирования. Заморозьте мочу сразу в жидком азоте, храните при температуре не менее минус 40 градусов Цельсия до проведения ЯМР-анализа.

Перед получением ЯМР приготовьте 0,2 молярного буферного раствора фосфата натрия в тяжелой воде. pH 7,4, содержащем одну миллимолярную ложную ложу, смешайте 30 микролитров мочи с 30 микролитрами буфера фосфата натрия. Перенесите 50 микролитров смешанного раствора в 1,7-миллиметровую ЯМР-капиллярную трубку с помощью стеклянного шприца объемом 50 микролитров, оснащенного металлической иглой.

Следите за тем, чтобы не было пузырей. Установите капиллярный адаптер поверх капилляра, содержащего образец мочи, и поместите его в 2,5-миллиметровую микротрубку ЯМР для пятимиллиметрового ЯМР-зонда. Эта комбинация трубок может быть использована в качестве стандартной пятимиллиметровой ЯМР-трубки для получения спектральных данных.

В этой демонстрации для сбора данных используется усовершенствованный ЯМР-спектрометр с частотой три 700 мегагерц. Получите одномерные протонные ЯМР-спектры с использованием параметров, описанных в письменном протоколе. После получения данных ЯМР с помощью экстракционного стержня удалите капилляр из 2,5-миллиметровой ЯМР-трубки, аккуратно закрутив адаптер капилляра, чтобы вытащить его после эвтаназии животных, как описано в письменном протоколе.

Подготовьтесь к биопсии печени. Во избежание загрязнения не используйте средства, содержащие спирт, и мойте инструменты водой или солевым раствором. Соберите биопсию печени из левой доли для воспроизводимой биопсии.

Собирайте последовательно в центре левой доли, избегая периферийных областей, где ткань более тонкая. Следите за тем, чтобы не проколоть желчный пузырь в случае подтекания желчи. Немедленно промойте салфетку водой или солевым раствором.

Немедленно заморозьте биопсию в жидком азоте и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия до проведения ЯМР-анализа Чтобы подготовиться к H-R-M-A-S-N-M-R, вставьте третью биопсию в циркониевый ротор и заполните оставшийся объем чистой тяжелой водой для ЯМР-блокировки. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузыри, так как они могут изменить качество последующего шимминга и сбора данных. Вставьте тефлоновую прокладку объемом 50 микролитров с помощью цилиндрического винта.

Открутите его и откалибруйте с помощью глубиномера с короткой стороны. Поместите штифт резьбы на распорку и аккуратно прикрутите его отверткой. Сушите птичник, любые остатки воды с кусочком салфетки.

Далее поместите колпачок в верхнюю часть ротора и вставьте его в пакер ротора. Сильно нажмите, пока колпачок не окажется на месте. Между ротором и его крышкой не должно оставаться пространства, отметьте половину нижней части ротора черным маркером, чтобы обеспечить оптическое определение скорости вращения.

Как только ротор будет достаточно упакован, поместите его внутрь ЯМР-спектрометра и начните вращать до пяти килогерц. Здесь. Используется усовершенствованный трехполосный спектрометр с частотой 500 МГц. Получение спектра протонного ЯМР с помощью последовательности импульсов CP MG.

Согласно рекомендациям производителя, обильный альфа- и числовой пик альфа- и числового дублета глюкозы на уровне 5,22 частей на миллион может быть использован для калибровки полученных спектров ЯМР. Чтобы распаковать ротор, снимите крышку, с помощью средства для снятия крышки открутите штифт резьбы и снимите тефлоновую проставку. С помощью цилиндрического винта аппарат можно тщательно промыть с использованием воды и моющего средства.

Появление кишечных микробных сометаболитов в процессе колонизации наглядно проиллюстрировано в этом протонном спектре метаболического профиля мочи у животного, колонизированного через 20 дней. Это животное не выделяло в послушном сульфате и очень малых количествах фенилацетилглицина, сокращенно PAG и сульфата клеток в стерильном состоянии. По мере прогрессирования колонизации эти три маркера белкового метаболизма в микробиоте кишечника значительно увеличиваются и достигают равновесия на 20-й день.

Интегрируя конкретный триплетный пик PAG, стало возможным количественно оценить увеличение этого конкретного маркера с течением времени. На этой диаграмме представлена средняя концентрация ПАГ во время колонизации для группы из семи животных с помощью спектроскопии протона H-R-M-A-S-N-M-R, получен метаболический профиль печени двух мышей до и после колонизации. Этот рисунок хорошо иллюстрирует информацию, которую можно получить из метаболического профиля на основе A-M-A-S-N-M-R.

Можно визуализировать многочисленные аминокислоты, а также метаболиты, полученные в результате энергетического метаболизма. Эти профили также содержат информацию, относящуюся к окислительному стрессу, метаболизму нуклеотидов и метаболизму метиламина. В этом примере совершенно ясно, что у стерильных мышей почти нет гликогена и очень низкое количество глюкозы и триглицеридов.

Таким образом, следуя этой процедуре, можно применять несколько статистических инструментов, таких как химиотерапия, чтобы кластеризовать логические выборки в соответствии с метаболическим профилем и выделить биомаркеры, связанные с метаболическим статусом.