Пример подготовки Микобактерий туберкулеза Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

Metabolomic профиля

Целью этой процедуры является анализ микобактерий туберкулеза, бесклеточных экстрактов с помощью метаболомики ЯМР в первой культуре, а также сбор клеток на соответствующей стадии роста. Затем лизируют клетки и получают бесклеточные экстракты для анализа. Повторно суспендируйте лиофилизированные экстракты в буфере для ЯМР-анализа.

Наконец, соберите данные ЯМР и проанализируйте спектры с помощью программного обеспечения для идентификации метаболитов. В конечном счете, ЯМР-анализ микобактерий туберкулеза используется для демонстрации сохранения метаболитов на различных уровнях лечения. Метаболомика ЯМР может быть применена к ключевым аспектам физиологии микобактерий туберкулеза, таким как важные метаболические пути.

Это понимание имеет решающее значение для выяснения механизмов действия лекарств и резистентности, а также для определения новых мишеней для разработки лекарств. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за неспособности обрабатывать все образцы одинаково, что приведет к ненужным вариациям и результатам из моей лаборатории. Стивен Лука, аспирант PhD, продемонстрирует процедуры работы с образцами для обработки ЯМР Из моей лаборатории руководитель исследовательской лаборатории и Роберт Фентон, третий техник-исследователь, продемонстрируют процедуры обработки культур микобактерий туберкулеза при проведении лечения M. tuberculosis.

Исследования проводились в соответствии с практиками третьего уровня биобезопасности, определенными в институциональных руководящих принципах. Хотя на этикетках в этом видео из соображений биобезопасности написано «микробактерия туберкулеза», в этой демонстрации использовалась непатогенная микобактерия магматическая. Начните с размораживания 50%-ного глицеринового запаса M. tuberculosis на льду.

Внесите 0,15 миллилитра в 110 миллилитров бульона M-A-D-C-T-W в 250 миллилитров ER, и моя колба выращивает культуры при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 100 оборотах в минуту в течение примерно шести дней. Если антибиотики не нужны, альтернативные добавки или другие методы лечения не требуются. Собирайте урожай культур для культур, требующих обработок.

Оставьте 0,5 миллилитровую Eloqua на льду для культивирования, титрования и контроля качества. Затем выполните желаемую обработку и поместите культуры обратно в шейкер по истечении периода времени. Удалите один миллилитр и определите наружный диаметр 600.

Кроме того, зарезервируйте образец объемом 0,5 миллилитра для посева, титрования и контроля качества. Поддерживайте клетки на льду на протяжении всего оставшегося протокола. Соберите клетки в четыре пробирки по 50 миллилитров методом центрифугирования после промывки 15 миллилитрами ледяной воды двойной дистилляции.

Риз суспендирует гранулы в 10 миллилитровых аликвотах. Извлеките две аликвоты и гранулу путем центрифугирования, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в конечном объеме одного миллилитра дважды дистиллированной воды. Если требуется одноклеточная суспензия, свободная от комков, пропустите клетки через иглу 27 калибра.

Трижды переложите суспензию клеток объемом в один миллилитр в двухмиллилитровую винтовую крышку, содержащую лизирующую матрицу В. Поместите гомогенизатор быстрого приготовления 24 лизиса внутрь шкафа биобезопасности. Поместите образцы в держатель образцов, фиксирующий пластину с фиксирующими спицами. Затем обработка в течение 60 секунд при скорости шесть метров в секунду.

Затем центрифугируйте образцы до остатков гранулированных клеток и неповрежденных клеток. Затем пропустите супинат через шприцевой фильтр 0,2 микрона в стерильную трубку для контроля отсутствия жизнеспособных клеток. Тарелка 0,1 миллилитра образца на MADC. Агар.

Заморозьте образцы в ванне с сухим льдом на основе этанола и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к лиофилизации и обработке на ЯМР-установке. Через два месяца проверьте пластины, чтобы убедиться в отсутствии колониеобразующих единиц. Если пользователь CF не найден, образцы могут быть изъяты из лаборатории BSL three для дальнейшего анализа в стандартной установке ЯМР.

После измельчения образцов до сухости ресуспендируют в 0,7 миллилитрах ЯМР-буфера и переносят в микроцентрифужную пробирку на три минуты по 13 000 раз. G, удалите 0,6 миллилитра и переложите в пятимиллиметровую ЯМР-трубку. Благодаря анализу среды специализированный штатив облегчает загрузку нескольких ЯМР-пробирок в спиннеры на нужную глубину.

Затем перенесите образцы в ЯМР-спектрометр, чтобы вставить в A-B-A-C-S один автоподатчик на 20 образцов. Чередование необработанных и обработанных лекарственными культурами. Первый образец должен быть предварительно загружен в магнит в начале автоматического прогона.

Чтобы откалибровать прибор, оптимизируйте длину импульса 90 градусов для одного образца и настройте прибор для остальных образцов. Используйте значок NMR и оболочку града. Автоматизируйте блокировку, шимминг и сбор данных ЯМР для каждого образца.

Для одномерного спектра ЯМР водорода выберите последовательность импульсов с подавлением воды и формированием возбуждения. Установите в общей сложности 32 000 точек данных, 128 сканирований и 16 фиктивных сканирований для спектра контроля качества двух DH one C C 13 hs. Выберите последовательность импульсов.

Выберите всего 2048 точек данных с шириной развертки вдоль прямого измерения H one и 64 точки данных с шириной развертки вдоль косвенного измерения C 13. Также укажите сбор спектра с 128 сканированиями и 16 фиктивными сканированиями для получения хорошего сигнал/шум. Спектр m tuberculosis генерировал около 400 пиков, включая 50 известных метаболитов.

Например, обработка данных, как подробно описано в сопроводительной рукописи, позволила получить спектр метаболитов, которые прямо или косвенно связаны с D. аланиновым путем. Величина пиковых интенсивностей пропорциональна концентрации метаболитов, присутствующих в клеточном экстракте, поэтому относительные возмущения в метаболитах и метаболических путях могут быть количественно оценены между образцами и обработкой. Метаболомика LMR открывает путь для исследований в области бактериологии для изучения физиологии и патогенеза зрительных и микробактериальных других патогенных или непатогенных микроорганизмов.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как готовить экстракты нескольких клеток туберкулеза для метаболомики ЯМР, и, что важно, поддерживать последовательность на протяжении всего протокола для получения надежных результатов.