Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по В Vivo Электропорация

Джейн переведена на развивающееся внутреннее ухо мыши in vivo, электропорация Лин Ванг, Хан Джанг и Джон Бурганди, Орегонский центр исследования слуха, Орегонский университет здоровья и науки.Хорошо. Меня зовут Джон Бурганди. Моя лаборатория находится в Орегонском исследовательском центре слуха при Орегонском университете здоровья и науки.

Меня зовут Анг. Я работаю плакатником в лаборатории Джонса. Я Анг, также работаю в лаборатории Джонса в качестве научного сотрудника.

Наша презентация разбита на четыре части. Первый – это вентральная лапаротомия. Мы демонстрируем натриевую ручку, анестезию на основе барбитала, как проверить адекватность анестезии, защиту роговицы, подготовку места операции, дезинфекцию паспорта операции по выживанию мышей, вентральный разрез по средней линии через кожу и брюшную стенку в операционном блоке и экстернализацию рогов матки.

Вторая часть – это внутриматочные микроинъекции. Мы демонстрируем транс-освещение эмбриона, эмбриона, переориентацию, микроинъекцию, пипетку, изготовление и микроинъекцию в Otis на эмбриональный день 11,5 и эмбриональный день 12,5. Часть третья – это электропорация in vivo.

Мы демонстрируем размещение электродов в виде лопастей и электропорацию эмбрионального 11,5-дневного мышиного помощника. Четвертая часть представляет собой репрезентативные результаты. Мы показали экспрессию GFP в поздних эмбриональных и ранних постнатальных улитках.

Это произошло в результате электропорации in vivo Otis экспрессией плазмиды на 11,5-й день эмбриональной вентральной лапаротомии. Мать надежно удерживается, захватывая кожу за шею, хвост и левую заднюю конечность. Внутрибрюшинная инъекция анестетика на основе пентобарбитала натрия вводится после взятия мазка из брюшной полости с 70% этанолом.

Мышь помещают в домашнюю клетку на четыре-пять минут, чтобы дать возможность анестетику подействовать. Для оценки адекватности анестезии используются щипки для ног и хвоста. Эта дама закрывается в ответ на укус хвоста, и ей требуется еще две минуты, прежде чем она перестает реагировать на вредные раздражители.

Стерильная офтальмологическая мазь наносится на глаза для защиты роговицы от высыхания. Мы подготавливаем место операции в вытяжном шкафу для химикатов, чтобы свести к минимуму распространение шерсти и перхоти. Мех сбривают тонким лезвием, чтобы обнажить кожу, покрывающую брюшную стенку.

Полное удаление шерсти способствует заживлению разреза после операции. Дезинфекция кожи живота достигается путем чередования проходов 70% этанола бетадина, и 70% этанола. Всегда проводите пальцем от рострального к няньке и используйте свежий хирургический ватный тампон или аппликатор с ватным наконечником.

После второго прохода с 70% этанолом мы немедленно поместили чертову брюшную поверхность вниз на стерильную простыню и положили ее на подогреваемую подушку на две-три минуты, чтобы согреть. Это удобное время для записи предоперационных данных в журнале операций по выживанию мышей. В качестве дополнительной информации мы прилагаем наш лист данных по выживанию мышей.

Рассмотрите возможность включения в него технического паспорта и протокола ухода за животными, чтобы ваш комитет по уходу за животными и их использованию мог видеть, как вы будете контролировать предоперационные операционные и послеоперационные данные. Мы заполняем один регистрационный лист для каждого хирургического субъекта. Мы предпочитаем проводить операции в стерильных условиях, хотя для грызунов это обычно не требуется.

Рабочая поверхность отделена от двигателя вентилятора и корпуса камеры, поэтому вибрация не передается пользователю. Во время микроинъекции мы добавили в качестве дополнительной информации схему изменений, которые мы внесли в наш ламинарный проточный колпак для облегчения внутриутробного переноса генов, основными изменениями являются низкая нагрузка на вату и трековые световые вырезы и скрытые розетки для шнуров питания приборов, а также путь прокладки для вспомогательных электрических цепей. Хирургический блок состоит из электрического мешочка для внутривенных вливаний, теплой ванны, манипулятора XY, Z, стереофлуоресценции, препарирующего микроскопа, волоконно-оптического источника света и хирургических инструментов.

Ножные педали используются для приведения в действие микроинжектора, электро пертер входит в фокус. Эндоскоп хирургических инструментов стерилизуется в автоклаве. Инструменты должны быть повторно стерилизованы между мышами с помощью стерилизатора со стеклянными шариками или путем повторного автоклавирования игольного привода.

Ножницы Балли, кольцевые щипцы и сосудистые щипцы являются основными инструментами. Сделайте вентральный разрез по средней линии, захватите кожу сосудистыми щипцами и иссеките покров ножницами с шариковым наконечником, удлините разрез на 10-14 миллиметров. Определите белую бессосудистую полосу соединительной ткани, называемую белой линией, и вентральную среднюю линию живота, надрежьте линейную белую кость ножницами с шариковым наконечником.

Будьте осторожны, чтобы не поцарапать живот или паховые жировые пакеты. Немедленно прополощите брюшную полость стерильным раствором Предогретого лактатного рингера. Оцените места разрезов на коже и брюшной стенке на предмет кровотечения.

Прямое надавливание тупыми щипцами остановит незначительное кровотечение, если оно присутствует, выведет правый и левый рога матки с помощью щипцов с кольцевым наконечником. Аккуратно зацепите правый маточный рог одним кольцевым концом щипца и подтяните матку к разрезу по средней линии. Свободной рукой аккуратно манипулируйте боковой стороной дамбы, чтобы облегчить зацепление матки.

Щипцы никогда не используются для сжатия матки и ее вытягивания. Поскольку это может повредить сосудистую сеть матки или эмбрионы, повторите процедуру экстернализации левого маточного рога. Немедленно орошите только что вынесенные наружу рога матки предварительно подогретым раствором лактата, осторожно вставьте внутрь жировые пакеты или кишечник, если они выйдут наружу вместе с маткой.

С этим сталкиваешься не часто. Часть вторая: микроинъекция матки. Дамба расположена под объективом для большого рабочего расстояния, а к стенке матки прикреплен оптоволоконный светильник с мягким кабелем.

Матку аккуратно прижимают пальцем свободной руки. Для облегчения определения ориентации эмбриона. Свет от оптоволоконного кабеля должен быть с наименьшей интенсивностью, необходимой для точной оценки ориентации эмбриона.

Интенсивный свет может передавать тепло в матку, что может вызвать осложнения. Мы держим волоконно-оптический светильник и матку в одной руке и используем палец на свободной руке для изменения положения эмбриона с помощью мягкой пальпации. В следующем видео с помощью микроскопии мы демонстрируем ЭК-клипсы и общие ориентации эмбриона, наблюдаемые маткой.

Зритель увидит микроскопический вид, который мы видим во время транс-освещения, хотя в черно-белом транс-освещении матки позволяет определить ориентацию эмбриона in vivo. В этом примере эмбрион находится в положении стойки на голове так, чтобы его вентральная поверхность была обращена к зрителю. Поворачивая матку вперед и назад, мы можем обнаружить правую и левую задние конечности, хвост и головной мозг левого глаза.

В этом примере эмбрион снова находится в положении стойки на голове, но повернут примерно на 90 градусов по отношению к передней задней оси. Плавно поворачивая матку вперед и назад, мы можем увидеть формы лопастей, которые определяют левую заднюю конечность и левую для конечности. Задний мозг также очевиден.

Эмбрион находится в вертикальном положении левой стороной к зрителю. Зарождающийся четвертый желудочек можно обнаружить в виде яркого пятна в заднем мозге. Также видны головной мозг левого глаза, левые четыре конечности и левая задняя конечность.

Мягкое давление на матку немного переориентирует эмбрионы, что позволяет обнаружить основной ствол первичной головной вены и ее переднюю и заднюю ветви, которые отмечены белой и черной звездочкой соответственно. Как мы увидим, Отис расположен на полпути между передней и задней ветвями первичной головной вены. Сам Отис не может быть виден через матку с помощью трансиллюминации.

В двух последовательных видеороликах для видеомикроскопии мы демонстрируем, как переориентировать эмбрион для микроинъекции в Otis assist. Цель состоит в том, чтобы определить эмбриональные ориентиры, которые позволяют интерполяцию местоположения отиса в боковой головке. Mesen con, наша цель состоит в том, чтобы переориентировать эмбрион из дорсального положения в боковое, чтобы мы могли идентифицировать первичную вену головы.

В дорсальном положении виден конечный мозг, четвертый желудочек и левый для конечности. Легкое давление на матку смещает ориентацию эмбриона с дорсальной на более позднюю. Головной мозг левого глаза, мезенцефалон и четвертый желудочек хорошо заметны.

Также очевидна первичная головная вена и ее задняя ветвь, обозначенная звездочкой. Передняя ветвь первичной вены головки четко не обнаруживается. Наша цель, опять же, состоит в том, чтобы сориентировать эмбрион таким образом, чтобы он мог идентифицировать первичную вену головки, но при большем увеличении, подходящем для микроинъекции матки.

Децидуальная полоса маточных сосудов и левый глаз видны в этой боковой перспективе. Легкое надавливание на матку смещает положение эмбриона, благодаря чему мы можем обнаружить четвертый желудочек левого глаза. Первичная головная вена и ее задняя ветвь, отмеченные звездочкой, первичная головная вена и ее ветви образуют форму американского футбола в вертикальном положении.

Глазной пузырь не виден через матку, но он расположен в центре вертикальных стоек. Линн инициировала последовательность инъекций для одного эмбриона. Она освещает матку, переориентирует эмбрион для микроинъекции и приносит микро-пипетку, наполненную быстрым зеленым цветом, в поле.

Пипетка для микроинъекций прикреплена к держателю пипетки, который удерживается манипулятором X, Y, z микромкм. Магнитная стойка манипулятора прикреплена к стальной пластине с тефлоновым основанием, что позволяет без усилий выполнять грубое позиционирование пипетки для микроинъекций. Игла приводится в движение с помощью ручки управления передним микрометром на манипуляторе соответствующим образом.

Изготовленные пипетки необходимы для травматичной микроинъекции в эмбрион мыши на ранней стадии Отис. Вытягиваем толстостенную стеклянную капиллярную трубку с помощью горизонтального съемника пипетки. Полученная пипетка, показанная на рисунке А, вручную разбивается щипцами в положении внешнего диаметра примерно от 14 до 16 микрон, указанном стрелкой в положении В. Грубый излом пипетки, показанный в С, является зубчатым и хрупким.

Мы наклоняем пипетку примерно на 20 градусов, чтобы заточить наконечник пипетки, как показано на панели D. Параметры для вытягивания и снятия фаски с пипеток для микроинъекций приведены в сопроводительном тексте. В следующих двух видеороликах микроскопии мы демонстрируем микроинъекцию в глазную область мыши на 11,5 и 12,5 день эмбриона. Наша цель – продемонстрировать микроинъекцию матки в эмбриональные сутки через 11,5 мышиных отиков.

Сначала мы вводим отики без присутствия матки, чтобы однозначно показать, как выглядит правильно направленная инъекция. Затем мы демонстрируем аутентичные трансматочные микроинъекции. Для этой первой инъекции матка была надрезана, чтобы позволить висцеральному мешку выдавиться, децидуальная полоса, лежащая над висцеральным желточным мешком, была удалена.

Плацента остается прикрепленной к матке, и эмбрион остается живым. При очаговом удалении матки мы видим четвертый желудочек, первичную головную вену, а также ее переднюю и заднюю ветви, пипетку и примерное расположение кисты белого цвета. В начале этой последовательности инъекций обнаруживается кровоток в сосудистой сети висцерального желточного мешка.

Пипетка продвигается через висцеральный желточный мешок, и dai вводится в ноту озиса, эндолимфатический проток дорсально и положение отиков в центре стоек. Отики находятся на полпути между передней и задней ветвями первичной головной вены, маточная микроинъекция в эмбриональный день. 11.5 Отика мышей требует обнаружения первичной вены головки и, по крайней мере, одной из ее ветвей для оценки местоположения глазного сустава.

Наша цель в этом схематическом примере обнаруживает как переднюю, так и заднюю ветви первичной вены головы, а территория OUC отмечена белым цветом. Более реалистичным является представление эмбриона при таком виде, при котором обнаруживается основной ствол первичной головной вены вместе с одной из ее ветвей, а в приведенном примере видна только задняя ветвь первичной головной вены, но этого достаточно для интерпретации расположения отиков. ПТ продвигается через матку, и в отики вводится краситель.

Мы ждем 30 секунд, чтобы краситель вышел из амниотической полости, после чего мы можем увидеть эндолимфатический проток дорсально и преддверие. В заключение мы видим при малом увеличении эмбрион, кисту которого мы только что ввели, чтобы обеспечить анатомическую перспективу: на этом снимке виден четвертый желудочек, левый глаз и сосудистая сеть матки. Мы демонстрируем транс- и микроинъекцию в эмбриональную кисту глаза на 12-й день и микроинъекцию в зарождающийся четвертый желудочек заднего мозга.

Трансиллюминация позволяет нам обнаружить первичную вену головы на этом левом боковом снимке, а также глаз. Пипетка продвигается через матку в глазный пузырь и умирает для заполнения ее просвета. Чтобы ввести четвертый желудочек, мы поворачиваем эмбрион на 90 градусов для дорсального обзора заднего мозга.

Введенная левая киста теперь находится с левой стороны. Пипетка продвигается через матку и быстро зеленая смешивается с лором. Конъюгированный декстран вводится в четвертый желудочек.

Обратите внимание, что объем введенного красителя не поступает в средний мозг in vivo. Флуоресценция оценивается после инъекции для подтверждения локализации декстрана в четвертом желудочке. Затем эмбрион переориентируется из дорсального положения в боковое.

Эндолимфатический проток на этом снимке сбоку проходит вентрально к четвертому желудочку. Флуоресценция in vivo подтверждает локализацию декстрана в четвертом желудочке. При рождении мы проверяем щенков на зеленую флуоресценцию в четвертом желудочке с помощью эпифлуоресценции.

У детенышей, занимающихся препарированием с помощью микроскопа с зеленой флуоресценцией в заднем мозге, есть внутреннее ухо, которое было обработано во время электропорации in vivo, которая была изменена во время эмбриогенеза. После заполнения кисты экспрессирующей плазмидой матку предварительно орошают теплым раствором лактата Рингера. Трансиллюминация способствует центрированию кисты ODU в электродном поле.

Металлическая головка волоконно-оптического светильника убирается от поверхности матки. Прежде чем начать последовательность импульсов прямоугольной волны, мы продемонстрируем в следующем видеоролике микроскопии полный цикл электропорации in vivo. Электропорация эмбрионального дня 11,5 глазной кисты мыши требует бережного размещения электродов лопастного типа на матке.

В этом примере киста левого глаза была заполнена экспрессирующей плазмидой, а матка была только что орошена лактатированными рингерами. Катод расположен латерально по отношению к заполненной глазной кисте, а ода расположена медиально в начале последовательности действия, глазная киста центрируется в поле лопасти. Матка мягко сжимается, и последовательность импульсов прямоугольной волны инициируется ножным педальным переключателем.

В идеале на один импульс подается ток от 60 до ста миллиампер. Затем матка освобождается и немедленно орошается. Только что орошенная матка возвращается в брюшную полость путем легкого надавливания кольцевыми щипцами.

После того, как матка интернализована, брюшную полость промывают примерно четырьмя милами лактатных рингеров, оставляя около одного миля лактатных рингеров в брюшной полости, чтобы помочь поддерживать гидратацию матери, которая будет пить меньше воды, чем обычно, сразу после операции на брюшной полости. Брюшная стенка, а затем кожа закрываются рассасывающимся швом с помощью игольчатого привода. В наш игольчатый отвертка встроены ножницы, которые упрощают закрытие.

Мы предпочитаем бегущий шов как для брюшной стенки, так и для кожи. Мы фиксируем каждый второй стежок, чтобы обеспечить дополнительную поддержку в месте разреза. Мы вводим нестероидные противовоспалительные препараты подкожно перед помещением дама в клетку для восстановления.

Проконсультируйтесь со своим ветеринарным персоналом о том, какие профилактические анальгетики предпочитают ваш институциональный комитет по уходу за животными и их использованию. Плотина укладывается в стерильную простыню и размещается на полу отапливаемой восстановительной клетки. В клетке для восстановления находится материал для гнездования, красная трубка для укрытия, лабораторный чау и бутылка с водой.

Клетка снова собирается с фильтрующим чепчиком сверху на следующее утро после операции. Самка прекрасно ухожена, передвижна и способна балансировать на задних конечностях, чтобы спросить о верхней части открытой клетки. Линия швов в области живота чистая, сухая и не имеет признаков расслоения, покраснения или отека.

Мы приложили документ, в котором обсуждается разработка протокола ухода за животными для внутриутробного переноса генов. Документ содержит формулировки, которые могут быть полезны при разработке протокола для конкретного учреждения в консультации с вашим комитетом по уходу за животными и их использованию. Часть четвертая, репрезентативные результаты.

На панелях репрезентативных результатов А и В показана репрезентативная улитка от щенка шестого дня после рождения, которому Отису была введена усиленная плазмида с усиленной зеленой флуоресцентной экспрессией белка на 11,5-й день эмбрионального периода, а затем электро. Боковая стенка улитки была удалена с середины и верхушки. Только экспрессия GFP присутствует от основания до середины улитки и следует за распределением маркера волосковых клеток миозина 7 А, показанного на панели В. Панель С показывает конфокальную проекцию эмбрионального дня с малым увеличением.

18.5 Мышиный орган Корде иммуно окрашен миозином Семь А антител Трансфицированные клетки распределены по всему органу корды. На панели D показана конфокальная проекция эмбрионального дня с большим увеличением. 18.5 Мышиный орган Корде, окрашенный цином. Семь.

Экспрессия GFP обнаруживается во внутренних и наружных волосковых клетках, межфаланговых клетках, столбчатых клетках и клетках TER. Электропорация опосредует перенос генов в Otis на эмбриональный день 11.5 Трансфективные предшественники, которые дают начало всем типам составляющих клеток в пределах органа corde.