Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по В Vivo Электропорация

Джейн перешла к теме «Развитие внутреннего уха мыши с помощью электропорации in vivo», Линг Ванг, Хан Джанг и Джон Бурганди, Орегонский центр исследований слуха, Университет здравоохранения и науки Орегона. Здравствуйте. Меня зовут Джон Бурганди. Моя лаборатория находится в Орегонском центре исследований слуха при Университете здравоохранения и науки Орегона.

Меня зовут Анг. Я представляю лабораторию Джона. Я также работаю в лаборатории Джона в качестве научного сотрудника.

Наше представление разделено на четыре части. Первая — вентральная лапаротомия. Мы демонстрируем анестезию на основе пентобарбитала натрия, способ проверки адекватности анестезии, защиту роговицы, подготовку операционного поля, дезинфекцию, заполнение листа данных по выживаемости мышей после операции, организацию операционного блока, разрез кожи и брюшной стенки по срединной линии живота, а также экстернализацию рогов матки.

Вторая часть посвящена транс-утробной микроинъекции. Мы демонстрируем метод транс-иллюминации эмбриона, переориентацию эмбриона, изготовление пипетки, а также выполнение микроинъекции в отоцисту на 11,5-й и 12,5-й дни эмбрионального развития. Третья часть посвящена электропорации in vivo.

Мы демонстрируем размещение электродов лопаточного типа и электропорацию у мыши на 11,5 эмбриональный день. Часть четыре представляет собой типичные результаты. Мы показываем экспрессию GFP в улитках на поздних эмбриональных и ранних постнатальных стадиях развития.

Это было получено в результате электропорации in vivo ткани ушного отростка (Otis) плазмидой экспрессии на 11,5 эмбриональный день. Часть первая: вентральная лапаротомия. Самку надежно фиксируют, захватывая кожу за шеей, хвост и левую заднюю конечность. После протирания живота 70% этанолом вводят внутрибрюшную инъекцию анестетика на основе пентобарбитала натрия.

Мышь помещают в домашнюю клетку на четыре-пять минут, чтобы дать анестетику подействовать. Для оценки достаточности анестезии используют щипковый тест лапы и хвоста. Данная самка проявляет дрожь в ответ на щипок за хвост, поэтому ей требуется еще две минуты, прежде чем она перестанет реагировать на болевые раздражители.

Для защиты роговицы от пересыхания в глаза наносят стерильную офтальмологическую мазь. Подготовку операционного поля проводят в вытяжном шкафу, чтобы минимизировать распространение шерсти и перхоти. Шерсть сбривают тонким лезвием, чтобы обнажить кожу, покрывающую брюшную стенку.

Полное удаление шерсти способствует заживлению разреза в послеоперационном периоде. Дезинфекцию кожи живота проводят путем попеременного протирания 70% ethanol, Бетадином и 70% ethanol. Всегда протирайте в направлении от рострального к каудальному концу, используя новый хирургический ватный тампон или ватную палочку.

После каждого прохода мы оцениваем глубину и качество дыхания во время дезинфекции, чтобы убедиться, что самка не реагирует. После второго прохода 70% ethanol мы немедленно положили самку брюшной стороной вниз на стерильную салфетку и поместили ее на нагревательную подушку на две-три минуты для согревания. Это удобное время для записи предоперационных данных в журнал выживаемости мышей при хирургическом вмешательстве. Мы приложили наш лист данных по выживаемости мышей при хирургическом вмешательстве в качестве дополнительной информации.

Рекомендуется приложить лист сбора данных и ваш протокол по уходу за животными, чтобы ваш институциональный комитет по уходу и использованию животных мог ознакомиться с тем, как вы будете отслеживать предоперационные, интраоперационные и послеоперационные данные. Для каждого хирургического объекта мы заполняем один журнал регистрации. Мы предпочитаем проводить операции в стерильной среде, хотя для грызунов это обычно не требуется.

Рабочая поверхность отделена от двигателя вентилятора и корпуса камеры, поэтому вибрация не передается пользователю. В качестве дополнительной информации мы приложили схему модификаций, внесенных нами в ламинарный шкаф для облегчения переноса генов in utero; основные изменения включают в себя низкий защитный бортик, вырезы под трековое освещение, скрытые розетки для шнуров питания приборов, а также кабель-каналы для вспомогательных электрических цепей. Хирургический набор состоит из пакета с раствором Рингера-лактатом для внутривенного введения, тепловой бани, манипулятора по осям XY и Z, стереофлуоресцентного диссекционного микроскопа, волоконно-оптического источника света и хирургических инструментов.

Ножные педали используются для срабатывания микроинъектора, электропорирующего устройства и при фокусировке. Хирургические инструменты для микроскопа стерилизуют в автоклаве. Инструменты необходимо повторно стерилизовать между операциями на разных мышах, используя стеклянный бисерный стерилизатор или повторно автоклавируя иглодержатель.

Основными инструментами являются зажимы с кольцами Balli и сосудистые зажимы. Выполните разрез по вентральной срединной линии, захватите кожу сосудистыми зажимами и иссеките кожный покров ножницами с тупыми кончиками, расширив разрез до 10–14 Millimeters. Определите белую аваскулярную полосу соединительной ткани, называемую linea alba, и вентральную срединную линию брюшной полости, затем рассеките linea alba ножницами с тупыми кончиками.

Будьте осторожны, чтобы не повредить кишечник или паховые жировые подушки. Немедленно промойте брюшную полость стерильным предварительно подогретым раствором Рингера-лактата. Осмотрите места разрезов кожи и брюшной стенки на предмет кровотечения.

Прямое давление тупыми щипцами позволит остановить незначительное кровотечение, если оно присутствует; с помощью кольцевых щипцов выведите наружу правый и левый рога матки. Осторожно захватите правый рог матки одним кольцевым концом щипцов и подтяните матку к срезу по срединной линии. Свободной рукой осторожно манипулируйте боковой стороной тела самки, чтобы облегчить захват матки.

Зажимы ни в коем случае нельзя использовать для сжатия матки и ее вытягивания. Поскольку это может повредить сосуды матки или эмбрионы, повторите процедуру экстернализации для левого рога матки. Немедленно промойте выведенные рога матки предварительно нагретым раствором Рингера с лактатом и аккуратно верните на место жировые подушки или петли кишечника, если они вышли вместе с маткой.

Это встречается редко. Часть вторая: микроинъекция в матку. Мать помещают под объектив с большим рабочим расстоянием, а гибкий оптоволоконный световод прикладывают к стенке матки.

Матку осторожно прижимают пальцем свободной руки. Это облегчает определение ориентации эмбриона. Интенсивность света из оптоволоконного кабеля должна быть минимальной, но достаточной для точной оценки ориентации эмбриона.

Интенсивный свет может передавать тепло матке, что может привести к осложнениям. Мы удерживаем волоконно-оптический световод и матку в одной руке, а пальцем свободной руки перемещаем эмбрион с помощью осторожной пальпации. В следующих трех видеоклипах с помощью микроскопии EC мы демонстрируем типичные положения эмбрионов, наблюдаемые в матке.

Зритель увидит микроскопическое изображение, которое мы наблюдаем при просвечивании; хотя изображение при просвечивании матки является черно-белым, такой метод позволяет определить ориентацию эмбриона in vivo. В данном примере эмбрион находится в положении «стойки на голове» вентральной поверхностью к зрителю. Перемещая матку вперед и назад, мы можем определить правую и левую задние конечности, хвост и левый глаз головного отдела.

В данном примере эмбрион снова находится в положении «головой вниз», но развернут примерно на 90 градусов относительно переднезадней оси. Осторожно перемещая матку вперед и назад, можно увидеть лопатообразные структуры, которые определяют левую заднюю и левую переднюю конечности. Также отчетливо виден ромб мозга.

Эмбрион расположен вертикально, его левая сторона обращена к зрителю. Зарождающийся четвертый желудочек виден как яркое пятно в заднем мозге. Также отчетливо видны левый глаз, левая передняя конечность и левая задняя конечность.

Слегкае давление на матку позволяет немного переориентировать эмбрионы, чтобы обнаружить основной ствол первичной головной вены, а также ее переднюю и заднюю ветви, которые отмечены белой и черной звездочками соответственно. Как будет видно далее, отис расположен посередине между передней и задней ветвями первичной головной вены. Сам отис невозможно увидеть сквозь матку методом транслюминации.

В двух последовательных видеоклипах с использованием микроскопии мы демонстрируем, как переориентировать эмбрион для микроинъекции с помощью вспомогательного устройства Otis. Цель состоит в том, чтобы определить эмбриональные ориентиры, позволяющие точно установить положение Otis в латеральной части головы. Таким образом, наша цель — переориентировать эмбрион из дорсального в латеральное положение, чтобы мы могли идентифицировать первичную головную вену.

В дорсальной позиции отчетливо видны средний мозг, четвертый желудочек и левая передняя конечность. Легкое давление на матку смещает ориентацию эмбриона с дорсальной на латеральную. Теперь хорошо видны левый глаз, головной мозг, средний мозг и четвертый желудочек.

Также отчетливо видны основная вена головы и ее задняя ветвь, отмеченная звездочкой. Передняя ветвь основной вены головы определена нечетко. Наша цель, повторимся, состоит в том, чтобы ориентировать эмбрион таким образом, чтобы можно было идентифицировать основную вену головы, но при большем увеличении, подходящем для микроинъекции в матку.

На данном латеральном ракурсе видны маточные сосуды, децидуальная полоса и левый глаз. Легкое давление на матку смещает положение эмбриона, что позволяет нам обнаружить четвертый желудочек и левый глаз. Основная головная вена и ее задняя ветвь, отмеченная звездочкой; основная головная вена и ее ветви по форме напоминают стойки ворот для американского футбола.

Отическую везикулу не видно через стенку матки, но она расположена по центру между держателями. Линн запустила последовательность инъекций для одного эмбриона. Она подвергает матку просвечиванию, переориентирует эмбрион для микроинъекции и вводит в поле зрения микроинъекционную пипетку, заполненную красителем fast green.

Микроинъекционная пипетка закреплена в держателе, который установлен на микроманипуляторе с осями X, Y, z. Магнитная подставка манипулятора прикреплена к стальной пластине с тефлоновым основанием, что позволяет легко осуществлять грубое позиционирование микроинъекционной пипетки. Игла продвигается вперед соответствующим образом с помощью ручки управления микрометром подачи на манипуляторе.

Изготовленные пипетки необходимы для проведения травматической микроинъекции в эмбрион мыши на ранней стадии Отиса. Мы вытягиваем толстостенные боросиликатные стеклянные капилляры с помощью горизонтального вытягивателя пипеток. Полученная пипетка, показанная на A, вручную разламывается пинцетом в месте внешнего диаметра примерно 14–16 микрон, указанном стрелкой на B. Грубый разлом пипетки, показанный на C, является зазубренным и хрупким.

Мы срезаем кончик пипетки под углом примерно 20 градусов, чтобы заострить её, как показано на панели D; параметры вытягивания и срезания микроинъекционных пипеток приведены в сопроводительном тексте. В следующих двух видеоклипах микроскопии мы демонстрируем микроинъекцию в отоцисту мыши на эмбриональных стадиях 11,5 и 12,5 суток. Наша цель — продемонстрировать микроинъекцию в отоцисту мыши на 11,5 эмбриональный день.

Сначала мы выполняем инъекцию в область уха без присутствия матки, чтобы однозначно продемонстрировать вид правильно направленной инъекции. Затем мы демонстрируем подлинную транс-утеринную микроинъекцию. Для первой инъекции матка была полностью разрезана, чтобы висцеральный мешок мог выйти наружу; при этом была удалена децидуальная полоса, покрывающая висцеральный желточный мешок.

Плацента остается прикрепленной к матке, и эмбрион жив. После фокального удаления матки видны четвертый желудочек, основная головная вена и ее передняя и задняя ветви, пипетка и примерное расположение кисты, отмеченное белым цветом. В начале данной последовательности инъекций регистрируется кровоток в сосудах висцерального желточного мешка.

Пипетку продвигают через висцеральный желточный мешок и вводят dai в отическую ноду, эндолимфатический проток дорсально, при этом позиция отики находится в центре вертикальных опор. Отика расположена посередине между передней и задней ветвями первичной головной вены; микроинъекция в утробку в эмбриональную отику мыши на 11,5 день развития требует обнаружения первичной головной вены и по крайней мере одной из ее ветвей для оценки местоположения отического циста.

На данном схематическом примере в качестве цели выступают как передняя, так и задняя ветви основной головной вены; область OUC отмечена белым цветом. В более реалистичном представлении эмбриона обнаруживается основной ствол первичной головной вены только с одной из ее ветвей; в показанном примере видна только задняя ветвь основной головной вены, однако этого достаточно для интерпретации расположения отоцист. PT проводится через матку, после чего в отоцисты вводится краситель.

Мы ожидаем 30 секунд, чтобы краситель вымылся из амниотической полости, после чего становятся видны эндолимфатический проток с дорсальной стороны и вестибулярный аппарат. В завершение мы представляем обзор эмбриона при малом увеличении, кисту которого мы только что инъецировали, для обеспечения анатомического контекста; на этом изображении видны четвертый желудочек, левый глаз и сосуды матки. Мы демонстрируем транс- и микроинъекцию в отическую кисту мыши на 12-й день эмбрионального развития, а также микроинъекцию в формирующийся четвертый желудочек заднего мозга.

Просвечивание позволяет обнаружить первичную головную вену в этом леволатеральном ракурсе, а также глаз. Пипетку продвигают через матку в отоцист, куда вводят краситель для заполнения его просвета. Для введения красителя в четвертый желудочек мы поворачиваем эмбрион на 90 градусов, чтобы получить дорсальный вид заднего мозга.

Введенная левая киста теперь находится с левой стороны. Пипетку продвигают через матку, и смесь fast green с конъюгированным декстраном lor вводят в четвертый желудочек.

Обратите внимание, что введенный объем красителя не проникает в средний мозг in vivo. Флуоресценция оценивается после инъекции для подтверждения локализации декстрана в четвертом желудочке. Затем эмбрион переориентируют из дорсального в латеральное положение.

На данном латеральном виде эндолимфатический проток расположен вентральнее четвертого желудочка. Флуоресценция in vivo подтверждает локализацию декстрана в четвертом желудочке. При рождении мы проводим скрининг щенков на наличие зеленой флуоресценции в четвертом желудочке с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.

При осмотре под микроскопом щенков с зелельной флуоресценцией в заднем мозге обнаруживается внутреннее ухо, которое было подвергнуто манипуляциям во время эмбриогенеза (часть три: электропорация in vivo). После заполнения кисты экспрессионной плазмидой матка промывается свежеприготовленным подогретым раствором Рингера-лактата. Просвечивание облегчает центрирование кисты ODU в поле электродов.

Металлическая головка волоконно-оптического осветителя отводится от поверхности матки. Перед запуском серии прямоугольных импульсов в следующем видеоклипе с микроскопией мы демонстрируем полный цикл электропорации in vivo. Электропорация отоцисты мыши на 11,5 эмбриональный день требует осторожного размещения электрода пластинчатого типа на матке.

В данном примере левая отоциста была заполнена экспрессионной плазмидой, а матка была предварительно промыта раствором Рингера-лактата. Катод расположен латерально по отношению к заполненной отоцисте, а анод — медиально; в начале последовательности электропорации отоциста центрируется относительно области действия электродов. Матка осторожно сжимается, и с помощью ножного переключателя запускается серия прямоугольных импульсов.

В идеале за один импульс подается ток силой от 60 до 100 мА. Затем матку отпускают и немедленно промывают. Промытую матку возвращают в брюшную полость, осторожно надавливая кольцевым зажимом.

После введения матки внутрь брюшную полость промывают примерно четырьмя мл раствора Рингера-лактата, оставляя около одного мл раствора Рингера-лактата в брюшной полости для поддержания гидратации самки, которая сразу после операции на брюшной полости будет пить меньше воды, чем обычно. Брюшную стенку, а затем кожу зашивают рассасывающимся шовным материалом с помощью иглодержателя. Наш иглодержатель оснащен встроенными ножницами, что упрощает процесс ушивания.

Для ушивания как брюшной стенки, так и кожи мы предпочитаем использовать непрерывный шов. Каждый второй стежок фиксируется для обеспечения дополнительной поддержки в области разреза. Перед тем как поместить самку в клетку для восстановления, мы подкожно вводим нестероидный противовоспалительный препарат.

Проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом относительно того, какие профилактические анальгетики рекомендуются комитетом вашего учреждения по уходу и использованию животных. Самку помещают в стерильную пеленку и укладывают на пол подогреваемой клетки для восстановления. В клетке для восстановления должны находиться гнездовой материал, красная трубка для укрытия, лабораторный корм и бутылка с водой.

На следующее утро после операции клетка собирается заново с установкой фильтрующего колпака сверху. Самка находится в ухоженном состоянии, передвигается самостоятельно и может удерживать равновесие на задних конечностях, проявляя интерес к открытому верху клетки. Линия шва на брюшной стенке чистая, сухая; признаки расхождения, покраснения или отека отсутствуют.

Мы приложили документ, в котором обсуждается разработка протокола по уходу за животными при внутриматочной передаче генов. Этот документ содержит формулировки, которые могут быть полезны при разработке протокола для вашего конкретного учреждения в ходе консультаций с комитетом по уходу за животными и их использованию. Часть четыре, репрезентативные результаты.

На репрезентативных панелях результатов A и B представлена типичная улитка щенка шестого дня после рождения, в отическую везикулу которого на 11,5 эмбриональный день была введена плазмида для экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка, после чего была проведена электропорация. Боковая стенка улитки была удалена в области среднего отдела и верхушки. Экспрессия GFP наблюдается только от основания до среднего отдела улитки и соответствует распределению маркера волосковых клеток myosin seven A, показанному на панели B. Панель C представляет собой конфокальную проекцию при малом увеличении на эмбриональный день.

Орган Кортевиуса мыши на 18,5 сроке развития, иммуноокрашенный антителом к миозину 7A; трансфектированные клетки распределены по всему органу Кортевиуса. На панели D представлена конфокальная проекция с большим увеличением органа Кортевиуса мыши на 18,5 embryonic day, окрашенного cin.Seven.

Экспрессия GFP обнаруживается во внутренних и наружных волосковых клетках, клетках Дейзе, столбовидных клетках и клетках TER. Электропорационный перенос гена в ушнуюي часть на 11,5 эмбриональный день трансфицирует клетки-предшественники, из которых развиваются все типы клеток органа Кортеи.