Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

Общей целью данного эксперимента является трансфекция отдельных или небольших групп ганглиозных клеток сетчатки с использованием электропорации in vivo у постнатальных мышей для изучения развития угальных проекций сетчатки. Это достигается путем хирургического воздействия на глазное яблоко и введения небольшого объема раствора плазменной ДНК непосредственно в сетчатку. В качестве второго шага электроды размещаются на глазном яблоке непосредственно над местом инъекции и подаются электрические импульсы, что позволяет перенести плазменную ДНК в нейроны сетчатки.

Затем, в желаемом возрасте, электропорированные клетки сетчатки и мозга собирают для визуализации трансфицированных ганглиозных клеток сетчатки и получают их проекции на результаты ЦНС, которые показывают флуоресцентное мечение как дендритов, так и аксональных БРА меченых ганглиозных клеток сетчатки в их различных подкорковых структурах-мишенях. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как внутриутробная электропорация сетчатки, заключается в том, что эта техника менее инвазивна и не препятствует ранним событиям наведения аксонов, таким как кроссинговер в зрительной хиазме. Это также позволяет нам помечать небольшую популяцию или отдельные ганглиозные клетки сетчатки у постнатальных мышей с точным пространственным и временным контролем.

Чтобы сделать электроды для электропорации, отломайте по одному зубцу от пары щипцов дюмон номер пять, а затем припаяйте проволоку у основания каждого зубца. Оберните основание проводами с изоляцией, скотчем и вставьте между зубцами пластиковую распорку, чтобы обеспечить пружинное действие. Как только электроды будут собраны вместе, подключите провод от одного контакта к ножной педали, которая последовательно подключена к электрическому стимулятору.

При нажатии на ножную педаль ток протекает по электродам. Далее подключите провод от другого контакта к электростимулятору. И, наконец, подключите электростимулятор к осциллографу и аудиомонитору.

Установите инжекторную систему на трехосевой микроманипулятор на столе с помощью съемника пипетки. Изготовьте стеклянные пипетки с длинным конусом и маленьким наконечником с помощью иглы, входящей в комплект nano Inject two. Наполните вытянутую пипетку минеральным маслом и закрепите ее на микроинжекторе.

Использование острых ножниц для микродиссекции. Обрежьте кончик установленной пипетки, чтобы создать отверстие в два-три микрометра. Наполните пипетку раствором для инъекций, набрав его вверх через открытый кончик.

Обезболите мышиные лопашки в H через четыре-пять дней после рождения путем гипотермии. И подтвердить обезболивающее состояние с помощью щипки на пальце ноги. Поместите мышь под наркозом под препарирующий эндоскоп и хирургическим путем откройте веко, разрезав по длине будущего века отверстие ножницами для микродиссекции, выпячивайте глазное яблоко, аккуратно надавливая вокруг глазницы с помощью пары щипцов.

Расположите пипетку рядом с глазным яблоком, отрегулировав микроманипулятор. Нажмите на ножную педаль системы микровпрыска, чтобы убедиться, что наконечник пипетки не засоряется одной рукой. Стабилизируйте выпяченное глазное яблоко, зажимая кожу вокруг глазницы щипцами другим способом.

Перемещайте микроманипулятор так, чтобы пипетка прокалывала пигмент сетчатки, эпителий и попадала в сетчатку. Выдайте нужное количество раствора, нажав ножную педаль, втяните пипетку и поместите наконечники электродов непосредственно над местом инъекции. С любой стороны глазного яблока, только касаясь поверхности, нажмите на ножную педаль, прикрепленную к стимулятору, чтобы завершить цепь и электропарад глазного яблока.

Аккуратно протолкните глазное яблоко обратно в глазницу и нанесите на разрез офтальмологическую мазь. Поместите мышей на грелку при температуре 36 градусов Цельсия до тех пор, пока они не придут в сознание и не вернут их матери, только трансфицированной RG CS. С помощью плазмиды и кодирования для Cree Recombinase и flock stop EGFP способен экспрессироваться.

Мечение одиночных клеток EGFP достигается благодаря относительно низкой концентрации используемой плазмиды кри; меченные EGFP одиночные ганглиозы сетчатки, дендриты клеток и аксоны могут быть визуализированы в плоской сетчатке. Другие типы клеток сетчатки, такие как звездообразующие омикрон, также могут быть помечены с помощью этой техники. Здесь мы видим пример кластера меченых EGFP нейронов сетчатки, включая RG CS и омикрон-клетки в плоской сетчатке на 14-й день после рождения.

Используя эту методику, мы можем проанализировать нацеливание RG CS на тему сетчатки в целом верхнем колусе из всех четырех основных координат сетчатки в одной и той же мыши после освоения. Эту технику можно выполнить за четыре-пять минут, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать фокальные инъекции таких растворов, как плазменная ДНК в постнатальную сетчатку и in vivo трансфекцию нейронов сетчатки с помощью электропорации.