In Utero инъекций Внутрижелудочковая и электропорации E15 эмбрионов мыши

Привет, я Уильям Тис из Krete Lab. Сегодня я и другие покажем вам внутриматочные инъекции эмбрионов мышей Е 15. Здравствуйте, меня зовут Лаура Элиас.

Сегодня я покажу вам, как подготовить пипетки для микроинъекций и загрузить пипетки для внутрижелудочковых инъекций и электропорации, которые мы будем проводить. Меня зовут Дэвид Кастанеда, и сегодня я буду помогать мне в инъекциях эмбрионов мышей in vivo in utero. Мы будем вводить плазмидную ДНК в боковой желудочек развивающихся эмбрионов мышей.

Мы нацеливаемся на кору CE этих эмбрионов, чтобы получить экспрессию различных молекул глиальными клетками, которые станут нейронами на более поздних этапах развития. При проведении этих внутриматочных инъекций вам нужно будет использовать несколько важных инструментов, и я покажу их вам. Сейчас. Мы используем более свободный, пару аддиновых щипцов.

Одна, одна пара, которая зазубрена, и другая пара, у которой есть маленький зубец на конце. Используем пару гемостатиков. Это ножницы.

А затем мы используем эти два степлера. Это более крупные, которые мы используем для крыс. Это меньший по размеру, который мы используем для мышей.

Используется скоба седьмого размера, а здесь используется скоба девятого размера, и они просто подпружинены. Некоторые вещи, которые мы используем здесь для помощи во время операций, мы просто используем простой волоконно-оптический источник света с двойной головкой. Мы используем нагревательную прокладку, которая просто циркулирует через нее теплой и нагретой водой, чтобы сохранить тепло.

Для рабочей поверхности мы используем эту систему электропорации производства BTX. У нас есть несколько весла разных размеров, которые мы используем в зависимости от того, насколько велики и велики эмбрионы. Синяя сторона – это положительная сторона.

Итак, для мышей мы используем изофторсодержащий вапорайзер. Мы обнаружили, что это увеличивает выживаемость матери и эмбрионов. Это также позволяет нам приводить животное в сознание и выводить его из него очень быстро и контролируемым образом.

Поэтому мы нашли его очень полезным. Итак, теперь мы собираемся скосить наши пипетки для инъекций. И это очень важно, чтобы у вашей пипетки было достаточно большое отверстие, чтобы вы могли загрузить свою ДНК, но также чтобы оно было очень, очень острым, чтобы не повредить эмбрион при введении.

И если вы повредите эмбрион во время инъекции, у вас будет гораздо более высокий уровень смертности. И это не очень хорошо. Так что это на самом деле очень важный процесс, как и в этой операции.

И сначала мы просто нальем немного воды на этот камень со скосом, который вращается здесь. И затем мы возьмем, давайте посмотрим здесь, просто палку. И мы поместим нашу пипетку, которую мы только что натянули на эту палочку, с помощью ленты.

И мы собираемся использовать один из этих микроманипуляторов, чтобы удерживать пипетку на скосе и позволить ей скосить здесь. Итак, и просто поместите это, и мы используем микроскоп для того, чтобы визуализировать кончик пипетки. И мы просто поместим его прямо в воду поверх скоса, чтобы было небольшое давление.

И вы можете видеть, как кончик прижимается к камню здесь. И дайте ему повернуться под углом в течение некоторого времени, по крайней мере, 15 минут. Мне нравится оставлять их даже, знаете ли, на час.

Иногда они просто становятся очень, очень острыми, но это определенно зависит от человека, как долго они скосят свои пипетки. Итак, вот у нас есть, вы можете видеть вверху, у нас есть пипетка, которая была вытащена, но еще не скошена. Таким образом, несмотря на то, что он острый, у него нет отверстия, через которое вы могли бы загрузить свою ДНК.

Теперь нижняя пипетка скошена, и вы можете видеть это красивое угловое отверстие, которое позволит вам загрузить вашу ДНК, но у него все еще есть острый конец, чтобы вы могли вводить его без каких-либо повреждений. Итак, теперь мы заполним наши инъекционные пипетки ДНК. Поэтому важно, чтобы вы подготовили свою ДНК без эндотоксинов, чтобы вы не вводили никаких липополисахаридов при введении ДНК.

Итак, мы возьмем нашу ДНК и подготовим нашу параформу. Итак, вы просто создадите свою параформу здесь, и вы захотите собрать свою ДНК и просто разместить ее в виде маленькой точки на этом фильме. И затем мы собираемся взять, поэтому я обычно беру на каждые 10 микролитров моей ДНК, которые я обычно использую, примерно от 1,5 до 1,7 микрограммов на микролитр.

Я использую около одного микролитра этого быстрого зеленого красителя. И это только для того, чтобы помочь нам локализовать инъекцию и убедиться, что мы успешно сделали инъекцию в желудочек. Затем я просто смешиваю этот быстрый зеленый краситель со своей ДНК.

Затем вы берете инъекционный электрод, и мы просто заполняем пипетку, оттягивая поршень. И вы можете видеть, если пипетка правильно скошена и имеет достаточно большое отверстие, DNI должен загружаться довольно легко. Иногда вам нужно просто двигать поршень вперед и назад, чтобы помочь ему правильно загрузиться.

И поэтому вы можете загрузить пипетку вот так. Итак, у нас есть ДНК, полностью загруженная в эту пипетку, и она готова к инъекции. Итак, я собираюсь помыть животное спиртом и йодом, но сначала, конечно, я хочу сделать ущипывание пальца ноги, чтобы убедиться, что животное полностью находится под водой и выглядит хорошо.

Так что я могу пойти дальше и начать. И я начинаю с того, что, как и в случае с крысами, мы делаем серию из трех таких случаев, начиная с этанола. Ладно, йод.

Чтобы свести к минимуму риск заражения, обратите внимание, что когда Уильям открывает салфетки, он очищает животное той частью, к которой его пальцы не прикасались. Чтобы по максимуму чтобы территория была чистой. Во-вторых, он делает только одну протирку, чтобы избежать распространения микробов по поверхности живота.

Ладно, отлично. Теперь я собираюсь немного привести себя в порядок, и мы наденем хирургические перчатки. Хорошо. Хорошо. Итак, теперь я раскрою мышь и вытащу маточные рожки, и я начну с небольшого щипка кожи.

Позвольте мне сделать еще один щипок за пальцы ног, чтобы убедиться, что она полностью внизу, и это хорошо. Итак, я зажимаю кожу и делаю там небольшую рябь, которая будет торчать вверх, что облегчит мне обрезку. И опять же, мы хотим сделать разрез прямо по средней линии животного, чтобы избежать каких-либо кровеносных сосудов.

Обычно я разрезаю кожу таким образом, отделяю ее и обнажаю мышцы. И как только вы это сделаете, вы сможете легко увидеть среднюю линию мышцы. Это очень определенно.

Я собираюсь захватить немного мышц там, отрезок, и это разрез хорошего размера. Я бы не хотел заходить дальше этого. Затем я использую эту свободу, чтобы поднять мышцу и кожу, оттянуть ее в сторону, а затем я делаю очень осторожное щупывание здесь и пытаюсь расположить ее между двумя эмбрионами, между двумя эмбрионами, чтобы я могла просто осторожно вытащить их, не повредив их вообще.

Иногда это проще, чем другие. Продолжим. Так что просто аккуратно протяните его, и как только я это сделаю, я смогу просто вытолкнуть его.

Важно никогда не ущипнуть эмбрионы, но вы просто хотите направлять их, просто подталкивать их. И как только вы их достанете, я хочу быть уверенным, что они всегда будут очень влажными. Вы не хотите позволять им высыхать.

И давайте посмотрим, я снова использую свой фризер здесь, прощупываю окрестности. Продолжим. Это здорово.

И поэтому я всегда хочу убедиться, что у меня есть все, потому что легко оставить одну там, если вы не проверяете яичники. Поэтому я всегда вытаскиваю их снова очень аккуратно, но ищу и смотрю, чтобы увидеть завязи в конце, который находится прямо там. И это просто выглядит как небольшая масса красной ткани у этого животного.

А затем переворачиваю их, возвращаюсь и проверяю другую сторону, и я вижу их там. Так что просто убедитесь, что они увлажнены, и мы готовы к работе. Я хочу обратить внимание на то, что Вы не должны, Вы должны захватывать эмбрионы очень осторожно и захватывать только эмбрионы.

Не хватайтесь за кровеносные сосуды, потому что они могут очень легко повредиться, и у животного произойдет кровотечение, и выживаемость резко упадет. Итак, первое, что мы хотим определить, это где находится голова в эмбрионе, которому мы хотим ввести ДНК. Мы делаем это, осторожно вращая животное и глядя на вентральную, каждую брюшную часть.

Итак, в этом конкретном примере у нас есть голова, которая находится справа от меня, а хвост – слева от меня. Средняя линия находится в этом положении, и Уильям собирается расположить эмбрион таким образом, чтобы я мог ввести его, как крысам. Я всегда располагаю их головой вверх, правой стороной матери ко мне.

И я начну с этого сейчас. Итак, вы можете видеть левый столб пола, сдвиньтесь совсем немного, и вы определенно сможете увидеть среднюю линию прямо там. Я постараюсь немного раскрутить его, чтобы он был в хорошей позиции для Дэвида.

Хорошо, и теперь я собираюсь приступить к инъекции в левый желудочек. Здесь мы видим, что левый желудочек целиком и полностью заполнен ДНК. Мы видим, что часть умирания распространилась на правый желудочек, а также на третий и четыре желудочка здесь.

Это хороший показатель хорошего впрыска. Итак, теперь мы приступим к электропередаче ДНК в клетки. Важным моментом здесь является знание того, какой электрод является положительной стороной.

Мы знаем, что тот, у которого синяя ручка, является положительным электродом, и эта сторона должна находиться в той стороне, в которую мы хотим электропорировать ДНК. Итак, поскольку у нас есть, мы вводим в левый желудочек большую часть DNAI, расположим положительный электрод с левой стороны вот так, а затем мы подаем пять импульсов, и все. Важно, чтобы электроды были полностью увлажнены в PBS, чтобы контакт между электродами и маткой был хорошим, а передача электрических импульсов была правильной.

Хорошо, теперь, когда исследование завершено, я собираюсь пойти дальше и вставить рога обратно внутрь. И вот как я это делаю: я очень осторожно перемещаю рога в одну сторону, опускаюсь сюда и захватываю мышцы и кожу, и мягко, мягко возвращаюсь туда. Хорошо, хорошо.

Будьте осторожны с мочевым пузырем. Я могу сделать и другую сторону. А затем мы просто даем ей небольшую встряску, чтобы они как бы успокоились там.

Можно немного использовать более свободный, чтобы аккуратно разровнять их. И что я собираюсь сделать, так это промыть три мила антимикотического антибиотика. Давайте сделаем щипцы на ногах, чтобы убедиться, что она полностью вышла, прежде чем я начну накладывать швы.

И это выглядит неплохо. Я собираюсь использовать Henry Shine. Номер шесть, хирургический шов.

Я предпочитаю делать блочные стежки. Я думаю, что они держатся лучше. И мы начнем с того, что просто продеваем иглу туда, протянем ее, обернем три раза, возьмемся за конец, протянем его.

1, 2, 3, отрежьте лишнее. Поэтому вам нужно просто продолжать равномерно спускаться по линии и тянуть туго. И вы хотите выйти прямо за пределы того места, где заканчивается разрез, и снова завязать.

И сейчас я приближаюсь к этому. Оттяните ткань или кожу немного назад. Там есть небольшое кровотечение.

Все должно быть в порядке. Мы держим под рукой прижигатель на случай кровотечения, которое иногда случается. И его прижигание хорошо работает, чтобы остановить это.

Итак, ладно, я уже за пределами разреза. На этом я остановлюсь. Протяните, сделайте петлю, прокрутите три раза, возьмитесь за петлю и потяните ее вниз.

Вращайтесь три раза, хватайтесь за петлю, протягивайте ее и выключайте лишнее. Вставьте иглу в острые предметы. А затем мы будем использовать степлер.

Мы будем использовать скобы седьмого размера для этого животного. Для мышей мы используем семь. Девять для крыс.

Просто возьмите кожуру, немного потяните ее вверх и начните обрезать. Возьмите зажим еще раз. Мы хотим равномерно расположить его до самого разреза, и это хорошо.

Затем протрите всей области спиртом. А затем мы сделаем ей инъекцию бупренорфина, чтобы убедиться, что она испытывает боль. И мы продолжим наблюдать за ней в течение следующих нескольких дней, чтобы убедиться, что она остается здоровой и не испытывает никакой боли.

Итак, теперь, когда мы сделали ей инъекцию бупренорфина, мы собираемся вернуть ее обратно в ее первоначальную клетку, чтобы она чувствовала себя комфортно, когда проснется, поместить ее в инкубатор и позволить ей оставаться там в течение 20 минут или около того, пока она полностью не придет в себя и не высохнет. Мы покажем вам, как выполнить in vivo в утробе матери, электропорацию плазмы, ДНК. Мы можем ввести любую молекулу.

Это может быть плед D или это могут быть наркотики. Факторы роста погибают. Если вам нужно, чтобы эти молекулы доставлялись в клетки, и они не проходят через пассивную диффузию, вам понадобится электропорация, а для этого молекулы должны быть заряжены.

Но в основном возможности безграничны. Один из примеров альтернативного вектора для доставки генов в клетку. Наши вирусы.

И в прошлом мы использовали ретровирусы, чтобы пометить gls ДНК и показать, как они делятся и становятся нейронами, в конечном итоге мигрируя в кору головного мозга после того, как вы помечаете клетки вирусом или используете электропорацию, или вводите наркотики или любые другие молекулы, чтобы повлиять на развитие мозга. Изучить это можно с помощью нескольких методик. Один из них — сделать TimeLapse, в котором вы будете делать органотипические культуры срезов.

А дальше вы будете следить за судьбой клеток с помощью микроскопа. Как вы можете видеть здесь, время 0.0. Мы начнем с кластера клеток, которые находятся очень близко к боковому желудочку.

И со временем мы видим, что клетки начинают мигрировать из желудочковой зоны к корковой пластине. Кроме того, мы фиксируем эмбрионы и проводим иммуногистохимию, чтобы изучить, знаете, различное распределение различных молекул или определить судьбу этих разных клеток. Еще одна возможность – заниматься электрофизиологией.

Мы идентифицируем ячейки-метки, а затем изучаем их электрические свойства. Что ж, спасибо, что были с нами сегодня. Мы надеемся, что вам понравятся наши демонстрации и что у вас получится провести свои эксперименты.

Если у вас есть какие-либо вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам. Знаете, удачи.