In Utero инъекций Внутрижелудочковая и электропорации E15 эмбрионов мыши

Здравствуйте, я Уильям Тис из лаборатории Krete. Сегодня мы с коллегами продемонстрируем вам технику внутриматочных инъекций эмбрионам мыши на 15-й день развития (E 15). Здравствуйте, меня зовут Лора Элиас.

Сегодня я покажу вам, как подготовить пипетки для микроинъекций и заполнить их для проведения интравентрикулярных инъекций и электропорации. Меня зовут Дэвид Кастанеда, и сегодня я буду помогать в проведении инъекций in vivo in utero в эмбрионы мышей. Мы будем вводить плазмидную ДНК в боковой желудочек развивающихся эмбрионов мышей.

Мы воздействуем на кору CE этих эмбрионов, чтобы добиться экспрессии различных молекул глиальными клетками, которые в дальнейшем развитии станут нейронами. Для проведения этих внутриматочных инъекций потребуется несколько важных инструментов, которые я сейчас вам продемонстрирую. Мы используем микропипетку и пару вспомогательных пинцетов.

Один, одна пара зазубренных и еще одна пара с небольшим зубцом на конце. Мы используем кровоостанавливающий зажим. Это ножницы.

Затем мы используем эти два степлера. Этот — более крупный, который мы применяем для крыс. А этот — меньшего размера, который мы используем для мышей.

Используется скоба седьмого размера, а здесь используется скоба девятого размера; они оснащены пружинным механизмом. Для облегчения проведения операций мы используем простой волоконно-оптический источник света с двойной головкой. Также мы используем термоковрик с циркуляцией подогретой воды для поддержания тепла.

В качестве рабочей поверхности мы используем эту систему электропорации производства BTX. В зависимости от размера эмбрионов мы используем электроды разных размеров. Синяя сторона является положительным полюсом.

Для мышей мы используем изофлурановый испаритель. Мы обнаружили, что это повышает выживаемость как матери, так и эмбрионов. Кроме того, это позволяет нам очень быстро и контролируемо вводить животное в состояние наркоза и выводить из него.

По этой причине мы сочли данный метод весьма полезным. Итак, теперь мы приступим к скошиванию кончиков инъекционных пипеток. Это очень важный этап, так как отверстие пипетки должно быть достаточно широким для загрузки ДНК, но при этом кончик должен быть очень острым, чтобы не повредить эмбрион при инъекции.

Если при инъекции вы повредите эмбрион, уровень смертности будет значительно выше. А это нежелательный результат. Таким образом, данный этап является критически важным процессом в этой операции.

Сначала мы просто нальем немного воды на этот вращающийся шлифовальный камень. Затем мы возьмем, посмотрим, обычную палочку и с помощью скотча закрепим на ней вытянутую нами пипетку.

Мы будем использовать один из этих микроманипуляторов, чтобы зафиксировать пипетку на скосе и обеспечить ее позиционирование. Мы установим ее, используя микроскоп для визуализации кончика пипетки. Затем мы аккуратно опустим ее в воду на поверхность скоса, чтобы создать небольшое давление.

Вы видите, как наконечник прижимается к шлифовальному камню. Оставьте его для зачистки скоса на некоторое время, как минимум на 15 минут. Я предпочитаю оставлять их даже на час.

Иногда они становятся очень, очень острыми, но длительность срезания кончика пипеток определенно зависит от каждого конкретного человека. Итак, здесь мы видим — сверху у нас вытянутая пипетка, кончик которой еще не срезан. Таким образом, несмотря на остроту, в ней нет отверстия, через которое можно было бы загрузить вашу ДНК.

Теперь кончик нижней пипетки скошен, и вы видите это аккуратное угловатое отверстие. Это позволит вам загружать ДНК, но при этом кончик остается острым, чтобы инъекцию можно было провести без повреждений. Итак, теперь мы наполним инъекционные пипетки ДНК. Важно подготовить ДНК в условиях отсутствия эндотоксинов, чтобы при введении ДНК не ввести липополисахариды.

Теперь мы возьмем ДНК; для этого подготовим парафильм. Раскройте парафильм и нанесите ДНК в виде маленькой капли на его поверхность. Обычно я беру по 10 µL ДНК, концентрация которой составляет примерно 1,5–1,7 µg/µL.

Я использую около 1 µL этого красителя fast green. Он нужен лишь для того, чтобы помочь нам локализовать место инъекции и убедиться, что введение в желудочек прошло успешно. После этого я просто смешаю краситель fast green со своей ДНК.

Затем возьмите инъекционный электрод; мы заполним пипетку, оттягивая поршень назад. Как видно здесь, если пипетка правильно скошена и имеет достаточно большое отверстие, DNI должен загрузиться довольно легко. Иногда требуется несколько раз переместить поршень вперед и назад, чтобы помочь жидкости загрузиться правильно.

После этого можно наполнить пипетку следующим образом. Таким образом, ДНК полностью загружена в пипетку и готова к инъекции. Теперь я промою животное спиртом и йодом, но сначала, разумеется, я проведу щипковый тест пальца лапы, чтобы убедиться, что животное находится в состоянии полного наркоза, и всё в порядке.

Итак, я могу приступать. Как и в случае с крысами, я начинаю с серии из трех таких процедур, начиная с этанола. Хорошо, йод.

Чтобы минимизировать риск инфицирования, обратите внимание, что при открытии салфеток Уильям очищает животное той частью, которой не касались его пальцы. Это необходимо для максимального обеспечения чистоты области. Во-вторых, он делает только один протирающий жест, чтобы избежать распространения микробов по поверхности живота.

Хорошо, отлично. Теперь я немного все очищу, и мы наденем хирургические перчатки. Хорошо. Хорошо. Итак, теперь я вскрою мышь и извлеку рога матки, начав с небольшого захвата кожи пинцетом.

Я еще раз зажму палец, чтобы убедиться, что она полностью находится под наркозом, — хорошо. Теперь я зажму кожу, чтобы создать небольшую складку, которую будет легче отрезать. И снова: разрез нужно делать строго по срединной линии животного, чтобы избежать повреждения кровеносных сосудов.

Обычно я делаю разрез кожи таким образом, отделяю её и обнажаю мышцу. После этого в мышце становится отчетливо видна срединная линия. Она очень выражена.

Я захвачу немного мышцы и сделаю надрез. Размер разреза оптимален; я бы не стал делать его больше. Затем я использую этот зонд, чтобы приподнять мышцу и кожу, отодвигаю их в сторону, после чего очень осторожно ввожу зонд внутрь и пытаюсь расположить его между двумя эмбрионами, чтобы аккуратно извлечь их, не повредив.

Иногда это дается легче, чем в других случаях. Вот так. Просто аккуратно протащите его, и как только я его проведу, я смогу их просто вытолкнуть.

Важно ни в коем случае не зажимать эмбрионы, а лишь направлять их, аккуратно подталкивая. После извлечения необходимо следить за тем, чтобы они всегда оставались увлажненными; нельзя допускать их высыхания.

Теперь посмотрим, я снова использую фрезу, чтобы исследовать область. Вот так. Отлично.

Поэтому я всегда стремлюсь убедиться, что извлек их все, так как легко оставить один внутри, если не проверить наличие яичников. Я снова очень осторожно вытягиваю их, стараясь обнаружить яичники на конце, которые находятся вот здесь. У этого животного они выглядят как небольшое скопление красной ткани.

Затем переверните их, вернитесь и проверьте другую сторону — я вижу их там. Таким образом, обязательно поддерживайте их гидратацию, и мы готовы к работе. Я хочу подчеркнуть, что эмбрионы следует захватывать очень осторожно и захватывать только сами эмбрионы.

Не захватывайте области, где проходят кровеносные сосуды, поскольку они очень легко повреждаются, что может привести к кровоизлиянию у животного и резкому снижению выживаемости. Поэтому первым делом необходимо определить положение головы эмбриона, которому будет вводиться ДНК. Для этого мы осторожно вращаем животное, осматривая каждую его вентральную часть.

Таким образом, в данном конкретном примере голова находится справа от меня, а хвост — слева. Срединная линия проходит здесь, и Уильям сейчас расположит эмбрион подходящим образом, чтобы я мог ввести инъекцию. Точно так же, как и с крысами, я всегда располагаю их головой с правой стороны матери, обращенной ко мне.

И теперь я приступлю к этому. Итак, здесь виден левый опорный стержень, сдвиньте его немного, и вы определенно увидите среднюю линию прямо здесь. Я постараюсь немного провернуть его, чтобы он находился в удобном положении для Дэвида.

Хорошо, теперь я приступлю к инъекции в левый желудочек. Здесь мы видим, что левый желудочек полностью заполнен ДНК. Также заметно, что часть красителя распространилась в правый желудочек, а также в третий и четвертый желудочки.

Это хороший показатель качественной инъекции. Теперь мы приступим к электропорации ДНК в клетки. Важным моментом здесь является определение того, какой электрод является положительным.

Мы знаем, что электрод с синей ручкой здесь является положительным, и его следует поместить с той стороны, в которую мы хотим электропорировать ДНК. Поскольку большую часть ДНК мы ввели в левый желудочек, я расположу положительный электрод слева, таким образом, а затем подам пять импульсов, и на этом всё. Важно, чтобы электроды были полностью смочены в PBS, чтобы обеспечить хороший контакт между электродами и маткой и надлежащую передачу электрических импульсов.

Итак, теперь, когда исследование завершено, я возвращаю рога на место. Для этого я очень осторожно сдвину рога в сторону, просуну руку внутрь, захвачу мышцу и кожу и аккуратно, очень аккуратно заправлю их обратно. Хорошо, готово.

Будьте осторожны с мочевым пузырем. Я могу заняться другой стороной. Затем мы просто слегка встряхнем ее, чтобы содержимое улеглось.

Можно использовать зонд, чтобы аккуратно их разгладить. Затем я промою область 3 мл антибиотика и антимикотика. Теперь проверим реакцию на сжатие пальца ноги, чтобы убедиться, что животное находится в глубоком наркозе, прежде чем я приступлю к наложению швов.

Это выглядит хорошо. Я буду использовать хирургический шов Henry Shine номер шесть.

Я предпочитаю делать блочные стежки. Мне кажется, они держатся лучше. Мы начнем с того, что просто проденем иглу, вытянем ее, обернем три раза, захватим конец и протащим его сквозь петлю.

1, 2, 3, отрежьте лишнее. Далее следует продолжать движение по линии, соблюдая равные интервалы и плотно затягивая нить. Нужно выйти немного за пределы края разреза и снова завязать узел.

И сейчас я приступаю к этому. Слегка оттяните ткань или кожу. Здесь наблюдается небольшое кровотечение.

Все должно быть в порядке. Мы держим под рукой коагулятор на случай кровотечения, которое иногда случается. И коагулятор эффективно справляется с его остановкой.

Итак, хорошо, я прошел линию разреза. На этом остановлюсь. Протягиваю нить, формирую петлю, делаю три оборота, захватываю петлю и затягиваю ее вниз.

Трижды оберните нить вокруг, захватите петлю, вытяните ее и обрежьте лишнее. Поместите иглу в контейнер для острых предметов. После этого мы воспользуемся степлером.

Для этого животного мы будем использовать скобы седьмого размера. Мы используем седьмой размер для мышей и девятый — для крыс.

Просто захватите кожу, немного оттяните ее вверх и начинайте накладывать зажимы. Снова возьмите зажим. Нам нужно располагать их с равным интервалом по всей длине, немного заходя за край разреза, — вот так будет правильно.

После этого протрите всю область спиртовой салфеткой. Затем мы введем ей инъекцию бупренорфина, чтобы исключить возникновение любой боли. Мы продолжим наблюдать за ней в течение следующих нескольких дней, чтобы убедиться, что она остается здоровой и не испытывает никакой боли.

Итак, теперь, когда мы ввели ей бупренорфин, мы поместим её обратно в исходную клетку, чтобы она чувствовала себя комфортно после пробуждения, поставим клетку в инкубатор и оставим её там примерно на 20 минут, пока она полностью не проснется и не обсохнет. Мы продемонстрировали вам, как проводить электропорацию плазмидной ДНК in vivo in utero. Таким образом, мы можем вводить любую молекулу.

Это может быть плазмидная ДНК или лекарственные препараты. Факторы роста. Если вам необходимо доставить эти молекулы в клетки и они не проходят путем пассивной диффузии, потребуется электропорация, а для этого молекулы должны быть заряжены.

Но, по сути, возможности безграничны. Одним из примеров альтернативного вектора для доставки генов в клетку являются наши вирусы.

В прошлом мы использовали ретровирусы для маркировки глиальных клеток ДНК, чтобы показать, как они делятся и превращаются в нейроны, в конечном итоге мигрируя в кору; маркировку клеток можно осуществлять с помощью вируса или электропорации, а также вводить препараты или любые другие молекулы для воздействия на развитие мозга. Изучать эти процессы можно несколькими методами. Одним из них является таймлапс-съемка органотипических срезов.

Затем с помощью микроскопа вы будете наблюдать за судьбой клеток. Как видно здесь, время 0,0. Мы начинаем с кластера клеток, которые находятся очень близко к боковому желудочку.

С течением времени можно заметить, что клетки начинают мигрировать из вентрикулярной зоны в сторону корковой пластинки. Кроме того, мы фиксируем эмбрионы и проводим иммуногистохимическое окрашивание, чтобы изучить распределение различных молекул или определить судьбу этих разных клеток. Еще одним возможным вариантом является проведение электрофизиологических исследований.

Мы идентифицируем меченые клетки, а затем изучаем их электрические свойства. Благодарим вас за внимание. Надеемся, что наши демонстрации были вам полезны и ваши эксперименты пройдут успешно.

Если у вас возникнут вопросы, пожалуйста, обращайтесь к нам. Желаем удачи.