Пробоподготовка для метаболомики: метод подготовки образцов клеток для профилирования метаболитов

Метаболомика — это исследование, направленное на идентификацию и количественное определение метаболитов, присутствующих в клетках. Чтобы подготовить образец, начните с посева клеток рака молочной железы вместе с питательной средой в две пластины, помеченные как тестовые и контрольные. Выдерживать в течение трех дней при температуре 37 градусов по Цельсию. Теперь удалите среду и добавьте свежую среду с эстрадиолом в тестовой пластине и обычной средой в контрольной пластине.

Эстрадиол связывается с рецептором эстрогена альфа в клетках рака молочной железы, вызывая определенные экспрессии, вызывая изменение метаболитного состава. Инкубируйте пластины в течение желаемой продолжительности. Замените среду ледяным фосфатным буфером или PBS для промывки клеток, а затем добавьте ледяной ацетон. Ледяные реагенты останавливают действие протеаз и тем самым предотвращают деградацию белка.

Теперь с помощью скребка отделите клетки от пластин и перенесите их в пробирки с помощью пипетки. Возьмите 20 микролитров этой клеточной суспензии на гемоцитометр и посчитайте количество клеток. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы готовим образцы из клеток MCF-7 для газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Используя клетки MCF-7, культивируемые по текстовому протоколу, добавьте в тарелку пять миллилитров ледяного 1x PBS. Затем наклоните пластину несколько раз перед снятием PBS. Повторите еще два раза, удалив как можно больше PBS после последней стирки. Добавьте 750 микролитров предварительно охлажденного ацетона в каждую пластину и соскребите клетки, затем объедините клетки из двух пластин в двухмиллилитровую пробирку на льду.

Чтобы подсчитать количество клеток для нормализации, для каждого лечения используйте две дополнительные пластины для количественного определения клеток. Затем для отделения клеток от пластин добавляют 2 миллилитра буфера HE и инкубируют в течение пяти минут. Тщательно перемешайте клетки с помощью пипетирования в буфере HE.

Затем используйте 20 микролитров клеточного раствора в гемоцитометре, чтобы подсчитать количество клеток под микроскопом. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия перед использованием газовой хроматографии и масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения метаболитов. Выполнение интегративного анализа в соответствии с текстовым протоколом.