Экстракция ДНК микобактерий с помощью взбивания шариков в специальном буфере с последующим рабочим процессом NGS

Наши диагностические исследования направлены на улучшение выявления лекарственной устойчивости туберкулеза в условиях ограниченных ресурсов, с акцентом на скорость и прагматизм. В диагностике туберкулеза существуют более комплексные генотипические анализы и даже ряд новых быстрых фенотипических анализов, и постоянно предпринимаются усилия по приближению этих тестов к месту оказания медицинской помощи. Но есть ряд прагматических барьеров, которые все еще существуют.

Нехватка ресурсов — от реагентов до инфраструктуры и логистики — по-прежнему остается серьезным препятствием. В условиях, когда анализ Cepheid Xpert выходит за рамки технической сложности, стандартизация протоколов в различных условиях затруднена. Таким образом, экстракция ДНК МТБ, как подробно описано в этой работе, является ярким примером этого.

Существует острая необходимость в расширении диагностики туберкулеза на основе секвенирования, но во многих лабораториях до сих пор отсутствует надежный способ извлечения высококачественной ДНК. Наша цель — поделиться методом, который является простым, практичным и подходит для учреждений с ограниченными ресурсами. Здесь мы представляем простой недорогой протокол, предназначенный для использования в условиях ограниченных ресурсов.

Он был проверен для применения в системах секвенирования нового поколения и совместим с автоматизированными системами работы с жидкостями. Для начала смешайте раствор хлорида натрия с буфером трис гидрохлорида, Triton X 100 и ЭДТА, чтобы получить буфер Triton. Перемешайте, помешивая, и добавьте сверхчистую воду до конечного объема 100 миллилитров.

Фильтр простерилизовать буфер перед использованием. Затем приготовьте 100 миллилитров низко-ЭДТА Трис-ЭДТА, соединив один миллилитр одномолярного Трис-HCl и 20 микролитров 0,5-молярного ЭДТА. Смешайте и залейте сверхчистой водой, чтобы достичь конечного объема в 100 миллилитров.

Затем фильтром простерилизуйте буфер. Чтобы подготовить пробирки для лизиса, с помощью лезвия скальпеля аккуратно отрежьте дно 1,5-миллилитровой пробирки с завинчивающейся крышкой чуть ниже точки перегиба. Отрежьте наконечник от наконечника пипетки P1000 и сделайте V-образный клин рядом с концом.

Вклините отрезанное дно пробирки с завинчивающейся крышкой в V-образный наконечник пипетки, чтобы получился совок. Наполните стерильную емкость 0,1-миллиметровыми шариками из силиката диоксида циркония. С помощью подготовленного совка переложите примерно 200 миллиграммов шариков в 1,5-миллилитровые пробирки с завинчивающейся крышкой.

Для приготовления бактериальной клеточной культуры перенесите пять миллилитров культуры микобактерий туберкулеза в 15-миллилитровую коническую центрифужную пробирку. Центрифугируйте его на максимальной скорости в течение 10 минут. Теперь с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров осторожно удалите всю надосадочную жидкость, кроме примерно 500 микролитров, не нарушая гранулы.

С помощью пипетки P1000 удалите остатки надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулу в 350 микролитрах специального буфера для тритонов, затем хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Нагрейте образец в сухой тепловой бане в течение 30 минут при температуре 95 градусов Цельсия.

Для приготовления мокроты перелейте от одного до пяти миллилитров образца мокроты в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Чтобы выполнить разжижение Дитиотреита, добавьте четыре объема 10-миллимолярного Дитиотреитола в образец мокроты, затем тщательно перемешайте в течение 30 секунд. Центрифугируйте образец на максимальной скорости в течение 10 минут.

Затем используйте серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, чтобы удалить все, кроме 500 микролитров надосадочной жидкости. Удалите остатки надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000, не повреждая гранулу. Суспендируйте гранулу в 350 микролитрах специального буфера для тритонов.

Чтобы выполнить сжижение гидроксида натрия NALC, добавьте четыре объема раствора гидроксида натрия NALC в образец мокроты. Перемешайте смесь в течение 30 секунд. Затем инкубируйте трубку в течение семи минут при комнатной температуре.

Теперь прибавьте PBS до отметки 50 миллилитров. Вихревым движением содержимое пробирки хорошо перемешать, затем центрифугировать пробирку на максимальных оборотах в течение 10 минут. После центрифугирования с помощью серологической пипетки объемом 50 мл выбросьте надосадочную жидкость, как было показано ранее.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 350 микролитрах специального буфера для тритонов. Сначала переложите 350 микролитров инактивированного образца в маркированную 1,5-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую 250 микролитров 0,1-миллиметровых гранул силиката диоксида циркония. Бисер взбивал лизат со скоростью 6,5 метров в секунду в течение 45 секунд с двухминутным отдыхом между циклами.

Центрифугируйте образец на максимальной скорости в течение двух минут, затем перелейте 150 микролитров надосадочной жидкости в новую пробирку с маркировкой. Далее вихревую очистку магнитных шариков, которые были приравнены при комнатной температуре в течение 30 минут, для их повторного суспендирования. Перенесите 180 микролитров магнитных шариков в образец ДНК.

Пипетка вверх и вниз 10 раз перемешать. После двухминутной инкубации при комнатной температуре поместите пробирку на магнитную решетку и подождите две минуты, пока раствор не исчезнет. Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите надосадочную жидкость.

Не снимая трубку с магнитной решеткой, добавьте 500 микролитров свежеприготовленного 70%-ного этанола вдоль противоположной стенки и подождите 30 секунд. По окончании последней промывки удалите остатки этанола с помощью пипетки объемом 10 микролитров и высушите на воздухе в течение двух минут. Как только бусины станут непрозрачными, снимите трубку с магнитной решетки.

Суспендируйте в 20 микролитрах буфера с низким содержанием ЭДТА Трис. Перемешайте с помощью пипетки или вортексинга, чтобы убедиться, что все шарики находятся в растворе, перед пятиминутной инкубацией при комнатной температуре. Далее поместите трубку на магнитную решетку на две минуты до прозрачности.

Затем перенесите менее 20 микролитров элюированной ДНК в новую меченую пробирку, чтобы избежать переноса шариков. Чтобы количественно определить ДНК микобактерий с помощью количественной ПЦР, нацеленной на 99 нуклеотидов микобактериальной атфЕ, соберите мастер-смесь QPCR на льду. Корректируйте мастер-смесь в зависимости от количества образцов и стандартов, включая 10%-ное превышение с учетом потерь при пипетировании.

Запустите термоамплификатор при температуре 95 градусов Цельсия в течение 60 секунд, затем 35 циклов при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 секунд и при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 секунд со скоростью нарастания 2,11 градуса Цельсия в секунду. Прогоните все образцы, стандарты и контрольные элементы в трех экземплярах. Здесь культуры микобактерий туберкулеза показали самые высокие концентрации ДНК среди всех протестированных условий.

Образцы мокроты с шипами показали все более низкий выход ДНК и повышенную изменчивость с уменьшением бактериального поступления, особенно в группе из 10 000 бактерий.