Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

Общей целью данного брачного анализа является оценка влияния мутаций в гене конъюгативного переноса на его способность влиять на перенос плазмид в контексте функционального комплекса секреции четвертого типа. Этот метод позволяет задавать специфические для белка вопросы, такие как выявление областей белок-белковых взаимодействий, которые происходят между транспортными белками, когда они собирают функциональную систему секреции четвертого типа в бактериальной конъюгации. В этом методе гены на больших конъюгативных плазмидах нокаутируются в результате гомологичной рекомбинации.

Функция гена оценивается путем предоставления гена-мишени нокаутам на плазмиде меньшего размера. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что организация и настройка являются ключом к успешному проведению этой процедуры. Для получения интерпретируемых результатов необходима надлежащая экспериментальная подготовка.

Начните этот протокол с приготовления расщепленной плазмиды pBAD33, как описано в текстовом протоколе. Запускайте каждый дайджест на агарозном геле. Используя УФ-шкаф и стерильную бритву, вырежьте из геля основную ленту весом 2,8 кг, которая соответствует последовательности катетеризации.

Работайте быстро, чтобы свести к минимуму воздействие ультрафиолета на ДНК. Извлеките ДНК из вырезанного гелевого среза с помощью набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию экстрагированной кошачьей кассеты методом полимеразной цепной реакции или ПЦР.

Приготовьте реакционную смесь в стерильной ПЦР-пробирке. Для гомологичной рекомбинации используйте праймеры, содержащие выступы, гомологичные последовательности гена-мишени. Установите отрицательный контроль, который содержит те же компоненты, за исключением замены матричной ДНК на воду двойной дистилляции.

Кроме того, настройте положительный контроль с использованием матричной ДНК и праймеров, эффективность которых доказана в реакции ПЦР. Аккуратно перемешайте все содержимое реакции с помощью пипетки. Затем амплифицируйте извлеченную кошачью кассету с использованием параметров ПЦР, перечисленных в текстовом протоколе.

Используйте всего пять микролитров каждой реакции, чтобы подтвердить правильный размер амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле. Очистите ампликон ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР с протоколом производителя. Добавьте 300 нанограммов амплифицированной кошачьей кассеты в 50 микролитров электрокомпетентных элементов DY330R, содержащих плазмиду pOX38-Tc на льду.

Аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать. Повторите этот шаг, используя немодифицированную плазмиду pBAD33 в качестве положительного контроля. Затем перенесите элементы в предварительно охлажденную одномиллиметровую электропорационную кювету.

Электропорировать элементы при напряжении 1,8 киловольта с постоянной времени 5,5 миллисекунд с помощью электропоратора. Сразу же, после подачи импульса, разбавьте клетки одним миллилитром среды SOC и переложите в свежую микропробирку. Инкубируйте клетки при температуре 32 градуса Цельсия в течение двух часов.

Далее распределите по 100 микролитров каждого образца на агаровые пластины, содержащие 10 микрограмм на миллилитр тетрациклина и 20 микрограммов на миллилитр левомицетина. Разложите аликвоту по тарелке с помощью стерильного разбрасывателя. Инкубируйте тарелку вверх дном при температуре 32 градуса Цельсия на ночь.

На следующий день выберите для удачных рекомбинантов. Кошачья кассета, введенная в клетку, будет подвергнута гомологичной рекомбинации с интересующим геном и создаст нокаутный клон хлорамфеникола pOX38-Tc. Разделите 300 нанограммов электропоратной плазмиды гена pK184 или мутантной плазмиды гена pK184 на 50 микролитров электрокомпотентных DY330R-клеток, содержащих нокаутирующую плазмиду хлорамфеникола pOX38-Tc, как и раньше.

Чтобы получить донорские клетки XK1200, выполните конъюгативное скрещивание с последующей электропорацией для получения клеток XK1200, харпорируя как нокаут хлорамфеникола, так и плазмиду PK184, как описано в текстовом протоколе. Приготовление в ночное время культуры этих донорских клеток XK1200 в 20 миллилитров стерильного LB с хлорамфениколом и канамицином. Также подготовьте клетки реципиентов MC4100 в 50 миллилитрах LB с 50 микрограммами на миллилитр стрептомицина, используя клетки из запасов глицерина или из одной колонии на анг-агаровой пластине.

Выращивайте культуры при температуре 37 градусов по Цельсию, встряхивая при 200 оборотах в минуту. Добавьте глюкозу до конечной концентрации 100 миллимоляров ко всем донорским клеткам. На следующий день делайте 1 из 70 разведений из каждой ночной культуры отдельно по два миллилитра стерильного ЛБ с теми же антибиотиками.

Вырастите ячейки до середины логарифмической фазы при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. Центрифугируйте клеточную культуру для гранулирования клеток и выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте клеточную гранулу холодным стерильным LB, чтобы удалить антибиотики.

После центрифугирования второй раз, как и прежде, суспендируем клетки в двух миллилитрах холодного стерильного LB.In дублирую, аликвотируем 100 микролитров донорских клеток и 100 микролитров клеток реципиента к 800 микролитрам стерильных LB сред на один миллилитр общего объема. Дайте клеткам спариваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа без встряхивания. Через час заведите клетки на 30 секунд, чтобы нарушить брачные пары.

Затем поместите клетки на лед на 10 минут, чтобы предотвратить дальнейшее спаривание. Используя средние культуры и свежий стерильный LB, приготовьте шесть серийных разведений клеток донора и реципиента от 1 и 100 до 1 и 10 миллионов. На каждой из двух половин агаровой пластины, содержащей наладиксиновую кислоту, хлорамфеникол и канамицин, нанесите по 10 микролитров аликвот каждого разведения донорских клеток XK1200.

Повторите кровянистые выделения для разведения клеток реципиента MC4100 на агаровых планшетах, содержащих стрептомицин. Затем инкубируйте пластины на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию. Далее, используя вихревую смесь и свежий стерильный ЛБ, готовят шесть разведений трансконъюгантов.

Выберите трансконъюгантные клетки MC4100, которые содержат нокаут хлорамфеникола pOX38-Tc, но обнаружив по десять микролитров аликвот каждого разведения на каждой половине агаровых пластин, содержащих стрептомицин и хлорамфеникол. Повторите для обеих повторяющихся смесей. Затем инкубируйте пластины на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию.

Рассчитайте эффективность спаривания, подсчитав количество колоний из одной и той же пятнистости разведения для каждой донорской, реципиентной и трансконъюгантной клеток на соответствующих планшетах. Кроме того, подсчитайте колонии реципиентов для проверки на любое смещение, возникающее в результате большего числа трансконъюгантов, чем реципиенты при данном разведении. Рассчитайте эффективность спаривания как количество трансконъюгантных колоний, деленное на число донорских колоний, умноженное на 100, чтобы получить значение эффективности на 100 донорских клеток.

Когда ген tra-F системы секреции четвертого типа нокаутируется из плазмиды pOX38-Tc, это приводит к потере конъюгативного переноса парамифенокола pOX38-Tc traF, нокаутирующего плазмиду от донорских клеток к реципиентным. Однако, когда ген traF предоставляется in trans плазмидой traF PK184 и донорскими клетками, наблюдается восстановление конъюгативного переноса нокаутирующей плазмиды pOX38-Tc traF хлорамфеникола. При введении мутантов разведения traF и плазмиды PK184 в донорских клетках может наблюдаться потеря конъюгативного переноса нокаутирующей плазмиды pOX38-Tc traF хлорамфеникола.

Потеря конъюгативного переноса указывает на область белка, важную для белок-белковых взаимодействий в конъюгативной системе секреции четвертого типа. Затем эту область можно более подробно исследовать с помощью точечных мутаций, которые влияют на эффективность переноса. После освоения этой техники ее можно выполнять за один рабочий день с ожидаемым временем роста.

Этот протокол может быть выполнен на клетках, отличных от показанных здесь. Критическим аспектом на данный момент является то, что донорские и реципиентные клетки не содержат плазмиды, представляющей интерес. Так что при добавлении нокаутирующей плазмиды вы не получите противоречивых результатов.

При проведении этой процедуры важно быть очень организованным, так как существуют различные условия роста и антибиотики для донорских, реципиентных и трансконъюгированных клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как кристаллография, ЯМР или масс-спектрометрия, чтобы получить подробную структурную и функциональную картину интересующего белка.