Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать связанные с рибосомами SEC TED 70, зарождающиеся цепные комплексы или РНК, образующиеся во время трансляции в безклеточной системе in vitro. Это достигается путем введения 17-аминокислотной длинной последовательности SEC M в С-концевой конец интересующего гена и ее клонирования вниз по потоку от промотора транскрипции Т-7. Затем мРНК транскрибируется с помощью реакции транскрипции in vitro, а затем очищается.

Затем очищенная мРНК транслируется в системе экстракта S 30 E. coli с радиоактивными аминокислотами для маркировки синтезированного белка или зарождающегося полипептида. Наконец, вторые комплексы зарождающейся цепи, связанные с рибосомами Mr.Ed, выделяют с помощью сахарозы, градиента, центрифугирования и фракционирования. В конечном счете, можно получить результаты, показывающие, что зарождающиеся цепи стабильно связываются с 70-летней рибосомой путем анализа гель-электрофореза меченых полипептидов, выделенных из градиентных фракций.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как использование мРНК, лишенной стокового кодона, заключается в том, что в ней с высокой эффективностью обеспечивается прикрепление зарождающейся полипептидной цепи к 70 с рибосоме во время трансляции и последующей стадии центрифугирования. Кроме того, в отличие от технологии «без стоп-кордона», этот метод может быть использован с практически одинаковой эффективностью как в системе in vitro, так и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансляционного сворачивания белка, например, на каком этапе трансляции могут образовываться различные промежуточные продукты трансляционного сворачивания, а также помочь в дальнейшем проанализировать их структуру с использованием прямой или косвенной структуры.

Подходы к зондированию и определению Этот метод может помочь нам расшифровать путь сворачивания белка на рибосоме. В этом протоколе мы описали выделение 70 s рибосом, связанных по всей длине bine gamma B кристаллических зарождающихся цепей. Но этот метод может быть использован для выделения вариативной болезни практически любого белка, представляющего интерес.

Эта стратегия также может быть использована для выделения усеченных полипептидных цепей натина дермы Es. Как правило, отдельные новички в этом методе могут испытывать трудности на этапе центрифугирования градиентом сахарозы. Однако, по первому опыту, это не должно быть проблемой. Мы решили использовать вторую последовательность остановки для выделения кристаллических зарождающихся полипептидов гамма-В, связанных с 70, в качестве рибосомы после первоначальных, менее успешных попыток, которые включали использование мРНК, не имеющей стоп-кордона.

Более поздний способ не мог обеспечить стабильность RNC на последующих этапах центрифугирования с той же эффективностью, что и метод, включающий использование последовательности остановки SECM. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы, связанные с подготовкой градиента и разделением RNC, могут быть сложными для освоения, и это требует определенного уровня знаний для обеспечения воспроизводимых результатов. Начните с интересующего вас гена, который клонируется в любую плазмиду на основе T seven и/или SP six для получения рибосомных зарождающихся цепных комплексов или RNC.

Удлините С-конец полипептида-мишени, добавив последовательность, индуцирующую арест, из М, чтобы гарантировать, что фрагмент полипептида будет выдавлен из рибосомального туннеля. Добавьте гибкий глицин, богатый сирийскими веществами, линкер между белком и последовательностью SEC M для подготовки к транскрипции in vitro, фермента рестрикции, который будет резать вниз по потоку открытую рамку считывания для линеаризации матрицы ДНК. После проверки оптимальной концентрации ДНК используйте набор для транскрипции с высоким выходом в соответствии с инструкциями производителя для синтеза матричной РНК.

Используйте осаждение хлорида лития для очистки мРНК. Затем запустите образец на акриламид или гель арос, чтобы проверить его чистоту. Для перевода in vitro.

Используя систему кишечной палочки в воде, свободной от нуклеаз, добавьте смесь аминокислот в один миллимоляр за вычетом метионина, 10 единиц ингибитора рибонуклеазы 20, микрокюри 35 с метионина, 20 микролитров реакционной смеси, 24 микролитра восстановительного буфера и 24 микролитра кишечной палочки. Лизат. Разогрейте реакцию, инкубировав ее при температуре 30 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте от одного до двух микрограммов мРНК и инкубируйте еще 10-15 минут при температуре 30 градусов Цельсия.

Остановите реакцию, поместив его на лед, чтобы изолировать 70 с рибосомы, связанные с зарождающимися цепными комплексами или NCS. Нанесите слой реакции трансляции на 4,5 миллилитра градиента сахарозы от 5 до 30% в 20 миллимолярных кучах. Гидроксид калия pH 7,5 15 миллимолярный магний, 100 миллимолярный ацетат калия и одна миллимолярная центрифуга DTT при 41 000 об/мин в течение двух часов при четырех градусах Цельсия после центрифугирования фракционируют градиент сахарозы с помощью программируемой системы градиента плотности и детектора абсорбции, настроенного на 254 нанометра.

Соберите фракции, содержащие 70 s рибосомы, для дальнейшего анализа, чтобы определить, остается ли расширенный белок SEC M прикрепленным к 70 s рибосоме. Осадите белок в каждой градиентной фракции, добавив трихлоруксусную кислоту. На следующий день инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, центрифугируйте образцы при 14 000 раз G в течение 15 минут, чтобы гранулировать белок, промойте гранулы в соотношении ацетона к одному миллимолярному трису четыре к одному, pH HCL 7,6.

Высушите пеллеты на воздухе, затем снова суспендируйте их в буфере загрузки страницы SDS. Разрешите образцы с помощью страницы tris Trice SDS, затем закрепите и высушите гели и подвергните их авторентгенографии и фосфовизуализации, как показано здесь. После трансляции in vitro 70 S рибосомы выделяли с помощью сахарозы, градиента, центрифугирования и фракционирования, чтобы гарантировать, что кристаллический белок гамма-B остается стабильно связанным с рибосомой.

Фракции, содержащие 70 с, объединяли, обессосаливали, обменивали и подвергали дополнительному раунду центрифугирования градиентом сахарозы. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что SEC M может эффективно индуцировать трансляционную остановку кристаллических РНК гамма-В. После освоения этот метод может быть выполнен за один рабочий день, за исключением анализа гель-электрофореза зарождающейся цепи, который обычно включает в себя этап осаждения ТСА в течение ночи.

Очевидно, что при попытке выполнить эту процедуру крайне важно избежать контаминации РНК на любых этапах. Контаминация РНК может повлиять на трансляционную эффективность экстракта и привести к высвобождению зарождающегося полипептида из 70-й рибосомы. После этой процедуры можно получить NAST и полипептиды заданного ланксесса, стабильно связанные с 70-й рибосомой в зависимости от конечной цели.

Эти комплексы могут быть использованы для различных целей, таких как определение подтверждения связанных рибосомами зарождающихся цепей с помощью прямых и косвенных подходов, таких как ЯМР или фре, или тестирование фактора и связывания лиганда после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области структурной биологии и сворачивания белков к изучению подтверждения полноразмерных белков, связанных с рибосомами, а также промежуточных продуктов трансляционного сворачивания. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить и выделить зарождающийся полипептид, стабильно связанный с 70 s рибосомой, который в дальнейшем может быть использован для ответа на различные вопросы в области трансляционного сворачивания белка.

Не забывайте, что работа с радиоактивными изотопами и мечеными аминными кислотами, такими как, например, метионин А35, требует особых мер предосторожности и всегда должна учитываться при выполнении этой процедуры.