Определение белковых комплексов в Кишечной палочки С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Целью данного эксперимента является идентификация белка, белковых взаимодействий и субъединичного состава нативных комплексов MultiPro из кишечной палочки. Это достигается путем амплификации специфичных для последовательности продуктов линейной ПЦР, кодирования SPA-метки и селективного маркера, которые интегрированы и экспрессируются в виде карбокси-концевых слияний на фоне ddy 3, 3 0 с использованием системы рекомбинации бактерий Fage Lambda в качестве второго шага двухступенчатая очистка выполняется с использованием коровьего модлина и аффинных гранул Anti-Flag для эффективного восстановления белковых комплексов с низкой численностью. Затем связанные белки, на которые ссылаются коровий модлин, элюирующий буфер или CEB, расщепляют трипсином и обрабатывают масс-спектрометрией для идентификации белков.

Полученные результаты показывают, что несколько субъединиц основного фермента РНК-полимеразы, включая терминацию транскрипции, антидетерминированные факторы эффективно очищаются с помощью меченого белка D-субъединицы РНК-полимеразы, что указывает на то, что новые ассоциированные компоненты могут быть эффективно обнаружены с помощью этого подхода. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности при двухраундовой аффинной очистке, где тщательная обработка клеточных лизатов соответствующими буферными растворами абсолютно необходима для обеспечения успеха в эффективном восстановлении комплексов с низкой и высокой концентрацией нагрузки из крупномасштабных культур. Этот протокол начинается с нацеливания специфических амплифицированных последовательностей на штамм DDY 3 30, в котором механизм красной рекомбинации Lambda экспрессируется так, как описано в письменном протоколе.

Затем, когда система рекомбинации бактерий фарж Лямбда экспрессирует штамм в течение ночи в двух миллилитрах среды Luria bati или LB при 32 градусах Цельсия, встряхивая со скоростью 180 оборотов в минуту на следующий день, инокулируют один миллилитр ночной культуры в 70 миллилитров свежей среды LB в коническую колбу объемом 500 миллилитров. Выращивайте инокулюм при температуре 32 градуса Цельсия, встряхивая со скоростью 180 об/мин, пока наружный диаметр 600 не достигнет примерно 0,8. Индуцируйте клетки, инкубируя колбу на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия, осторожно встряхивая при 180 оборотах в минуту в течение 15 минут.

Сразу после индукции выдержать колбу в ванне с ледяной водой и кашицей не менее 30 минут с встряхиванием. После сбора и промывки клеток, как описано в письменной процедуре, Риз суспендирует клеточную гранулу в 700 микролитрах льда, холодной, стерильной воды, в результате чего клетки становятся электрокомпетентными с помощью электропорации. Введите один микролитр очищенного ампликона в 40 микролитров электрокомпетентных ячеек.

Элементы подвергаются электропорации после гомологичной рекомбинации и интеграции. Трансформанты, которые успешно рекомбинировали кассету с меткой косой черты в хромосому, выбраны на основе устойчивости к мицину может выбрать несколько трансформаторов для вестерн-блоттинга, чтобы проверить правильную генерацию помеченных SPA гибридных белков с антителом Anti-Flag M two, которое является селективным против флаговых эпитопов SPA метки Переведите 10 миллилитров ночной культуры в 990 миллилитров свежего туберкулезного масла. Дополняется 25 микрограммами на миллилитр банки мицина в четырехлитровой колбе.

Выращивайте культуру при температуре 32 градуса Цельсия с постоянным встряхиванием при 250 об/мин в течение пяти-шести часов, пока наружный диаметр 600 не достигнет двух-трех. Перенесите культуру одного литра кишечной палочки SPA в чистые бутылки для центрифугирования и вращайте клетки при температуре четыре градуса Цельсия и 3 993 раза G в течение 15 минут. После реанимации суспензируют клетки, как описано в письменном протоколе.

Переложите образцы в стерильный стаканчик из нержавеющей стали, помещенный на лед для ультразвуковой обработки. Погрузите зонд в образец и обрабатывайте ультразвуком в течение трех минут. После обработки ультразвуком дайте еще две минуты охладить образец от перегрева после центрифугирования лизата ультразвука.

Осторожно перенесите надосадочную жидкость S из центрифугирующей пробирки в полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров. Заморозьте образец с помощью жидкого азота и храните обработанный ультразвуком экстракт замороженных клеток не более шести месяцев при температуре минус 80 градусов Цельсия для использования в будущем. Чтобы начать аффинную очистку для замороженного экстракта ультразвукированных клеток, поместив пробирку в холодную воду, инкубируйте экстракт TH-клеток с тремя микролитрами бензо, нуклеазы в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

К этой смеси добавьте неионогенное моющее средство Triton X 100 и 200 микролитров суспензий Anti-Flag M две агробусины. Аккуратно перемешайте содержимое, вращая пробирку в течение трех часов при температуре четыре градуса Цельсия после трех часов вращения, центрифугируйте пробирку при температуре 1,700 G в течение шести минут. После центрифугирования тщательно удалите как можно больше сатифа, не нарушая гранулу с рыхлой скоростью.

Повторно суспендируйте гранулу в оставшейся SNA, а затем перенесите в колонну для подготовки полипропилена. Снимите нижние выпускные пробки колонны, чтобы позволить элюату стечь под действием силы тяжести. Течь. Затем промойте колонку пять раз 200 микролитрами одноразового буфера FC и приступайте к Cleve с TEV, как описано в письменном протоколе.

Следим за расщеплением быстро как сверху, так и снизу колонны плотно. Аккуратно перемешайте содержимое колонны, вращая в течение ночи на четыре градуса Цельсия после ночного вращения. Слейте воду из элюата, сняв верхнюю крышку и нижнюю пробку в новую колонну.

Промойте старую колонку 400 микролитрами одного связующего буфера Cal Modlin и 150 микролитрами суспензии связующих шариков Cal Modlin. Разбавьте связанный белок в четырех фракциях по 50 микролитров в свежей пробирке. Использование одного буфера элюирования Модлина x cal.

Разложите элюированную фракцию по двум чистым пробиркам в равных объемах. Затем высушите содержимое обеих пробирок с помощью скоростного пылесоса. Высушенный элюат из одной пробирки используется для запуска окрашивающего серебра геля, как описано в тексте, в то время как другой хранится при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Для дальнейшего использования в масс-спектрометрии к высушенному образцу добавьте 50 микролитров буфера для разложения и 0,9 микролитра 100 мкмольярного трисфина соляной кислоты, инкубируйте смесь в течение 45 минут комнатной температуры для этапа восстановления. Чтобы обеспечить алкилирование образца, после второго раунда инкубации добавьте в смесь один микрограмм трипсов. После инкубации образец инкубируйте либо при 37 градусах Цельсия, либо в течение ночи при комнатной температуре.

Обязательно остановите реакцию, добавив один микролитр уксусной кислоты. Затем подготовьте наконечник Millipore на молнии, наконечник для пипетки, как описано в тексте, для эффективного связывания пептида с наконечником трубки pep. Перемешайте пептидную смесь 20 раз, смойте пептидную смесь, которую она сделала до кончика, путем аспирации и дозирования моющего раствора.

Повторите эту процедуру дважды для эффективного связывания пептидной смеси с наконечником с наконечником, содержащим связанный пептид. Отсадите 10 микролитров смачивающего и уравновешивающего раствора и раздайте в чистую пробирку. Повторите этот шаг дважды.

После сушки элюированных образцов в скоростном вакууме образцы могут быть немедленно проанализированы с помощью масс-спектрометрии или храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия перед использованием. Микроколонки, используемые в этой процедуре, содержат примерно 10 сантиметров трехмикронной лунной смолы C 18 и подключены к источнику ионов nano electrospray pro Zion, который расположен на одной линии с прибором orbitrap. Бинарный насос ВЭЖХ с нанопотоком pro Zion используется для обеспечения стабильной скорости потока наконечника около 300 нанолитров в минуту во время разделения пептидов для достижения разбавления пептидов и создания градиента органического буфера в соответствии со сложностью образца.

Для данного образца SPA с кишечной палочкой подвижная фаза растворителя А содержит 95% градиентной воды ВЭЖХ и 5% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты, в то время как растворитель В содержит 5% градиентной воды ВЭЖХ и 95% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты после масс-спектрометрического поиска спектров с использованием алгоритма поиска в базе данных, такого как SeaQuest, по базе данных последовательностей белков кишечной палочки. Статистически отфильтруйте результат с помощью вероятностного алгоритма, такого как star quest, чтобы обеспечить низкий процент ложных обнаружений, как помеченный SPA сигма-фактор РНК-полимеразы, так и белок LA yak неизвестной функции, специально очищенный основным ферментом РНК-полимераза, включая альфа-бета и бета-прайм-субъединицы, а также фактором рециркуляции РНК-полимеразы. В отличие от меченой РНК-полимеразы, сигма-фактор yak L связывается дополнительно с существенным фактором антидетерминации транскрипции, что предполагает специализированную функцию в транскрипции.

Несколько других более мелких соочищающих белков также были обнаружены с помощью LCMS, которые не были заметны на геле, включая субъединицу РНК-полимеразы Омега и факторы транскрипции, терминации и детерминации, а также США и NUSD. И наоборот, в независимом эксперименте, помеченном как мобилизация серного оборудования, S-U-F-B-S-U-F-C и SUFD совместно очищены друг с другом, что указывает на совместное участие в биосинтезе железо-серного кластера в качестве единого комплекса скаффолдинга. Этот репрезентативный пример подчеркивает тот факт, что ранее хорошо изученные высокоаннотированные бактериальные комплексы MultiPro, участвующие в основных биологических процессах, часто имеют новые ассоциированные компоненты, которые могут быть эффективно идентифицированы.

При использовании этого подхода низкое число копий белка SUFB могло привести к слабой интенсивности сигнала по сравнению с сильной интенсивностью, наблюдаемой в экспериментах по снижению SUFC и SUFD для определения состава стабильных многокомпонентных белковых комплексов, оценки соочистки были присвоены взаимодействиям с высокой степенью достоверности с учетом уникальности приманочной добычи. Приманка Приманка и добыча Добыча Отношения добычи. Затем используются процедуры кластеризации графов, такие как алгоритм кластеризации Markoff. Дискретные белковые кластеры идентифицируются из секционированной вероятностной сети ИПП.

Предполагаемые сети взаимодействия могут быть визуализированы с помощью cyto scape. Объединение данных протеомики с дополнительными функциональными ассоциативными данными, полученными с помощью методов геномики, может быть использовано для исследования новых механистических ролей ранее аннотированных белков Ecoli. Здесь у кишечной палочки были определены подсети белковых комплексов и функциональных модулей, которые участвуют в качестве более широких функциональных окрестностей.

Основной иерархический кластер Грэхема показывает закономерности функциональных предсказаний и существующих аннотаций для функционально бесхозных и характеризуемых генов кишечной палочки, желтый и синий цвета представляют существующие и предполагаемые функции соответственно, в то время как интенсивность оттенков отражает оценки достоверности. Биологические процессы, связанные с различными окрестностями, обозначены на правых врезках, показаны отдельные компоненты репрезентативной окрестности на основе оценок сходства сети интегрированных физических и функциональных взаимодействий. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как можно выделить стабильные белковые комплексы из estia Coli с помощью аффинной очистки в сочетании с масс-спектрометрией.

В принципе, эта методика может быть применена для характеристики мембранных белковых комплексов или белковых комплексов от любых других видов для его рекомбинации по мере возможности.