Компьютерная томография наведением во временной области диффузного флуоресцентная томография у мелких животных для локализации рака биомаркеров

Общая цель следующего эксперимента — получить флуоресцентные изображения экспрессии рецептора эпидермального фактора роста в ортотопической модели глиомы у мыши. Это достигается путем инокуляции в левое полушарие головного мозга мыши линии A IIC клеток глиомы человека U2 51, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок. После двухнедельного роста опухоли мыши вводят коктейль из двух флуоресцентных трейсеров.

Затем мышь подвергают рентгенографическому сканированию на системе рентгеновского излучения для мелких животных для сбора анатомических данных, необходимых для точной реконструкции изображения. Эти данные используются для анатомического позиционирования источника и детекторов системы оптической томографии, а специализированное программное обеспечение применяется для сбора данных флуоресценции и построения итогового изображения. В конечном счете данный метод позволяет реконструировать изображение опухоли на основе гиперэкспрессии эпидермального фактора роста, используя как флуоресцентную, так и рентгеновскую визуализацию, точность которой можно сравнить с данными магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как флуоресцентная томография мелких животных на основе приборов с привязкой заряда, является то, что детектирование с помощью счетчиков одиночных фотонов с использованием фотоумножителей обеспечивает значительно более высокую чувствительность и динамический диапазон регистрации света. В конечном итоге этот метод может быть использован для мониторинга и оценки эффективности молекулярной терапии путем измерения экспрессии ее мишеней. В то время как подкожные опухоли легко визуализируются нетомографическими методами с помощью поверхностной визуализации, данная система предназначена для получения изображений сквозь ткани толщиной до нескольких сантиметров, что делает ее особенно подходящей для визуализации доставки контрастного агента и его проникновения в опухоли головного мозга.

Хотя этот метод позволяет получить представление об экспрессии биомаркеров рака, он также может быть применен для изучения других заболеваний, таких как инфекции, ожирение или возрастные изменения, например, при болезни Альцгеймера. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за диффузного характера распространения света в биологических тканях и сложности применения рентгеновской томографии для реконструкции диффузного света. Визуальная демонстрация данного метода имеет критически важное значение.

Поскольку этапы сбора данных и реконструкции изображений могут быть сложными в освоении, важно убедиться, что данные, полученные с помощью флуоресцентной системы, правильно откалиброваны. Программный пакет near fast был разработан для считывания оптических данных и использования изображений рентгеновской томографии для создания сетки конечных элементов, которая служит пространственным шаблоном для реконструкции флуоресценции. Для начала поместите анестезированную атимическую мышь (nude mouse) на стерильную хирургическую пеленку и, прежде чем продолжить, убедитесь в глубине анестезии, затем очистите и продезинфицируйте кожу в области разреза.

Используя Betadine, закрепите стерильную хирургическую салфетку над местом разреза; с помощью скальпеля сделайте небольшой разрез чуть левее срединной линии и в 0.5 сантиметрах кзади от интраокулярной линии. Очистите поверхность черепа, удалив соединительную ткань для идентификации анатомических ориентиров. После обнажения черепа с помощью высокоскоростного сверла со стерильным сверлом диаметром один миллиметр просверлите отверстие в двух миллиметрах левее центральной линии и в двух миллиметрах позади bgma.

Заполните шприц Hamilton Micros с тупоконечной иглой 27-го калибра суспензией клеток, предназначенных для имплантации. Затем поместите мышь в стереотаксическую раму. После этого убедитесь, что животное находится в глубокой хирургической и эстетической плоскости анестезии, используя тест с защемлением пальца, и накройте животное хирургической салфеткой.

Затем закрепите заполненный шприц на стереотаксической раме. Расположите шприц над отверстием в черепе и введите кончик иглы на 3 мм ниже поверхности черепа. После этого выведите иглу на 1 мм назад, чтобы создать полость.

Следующим шагом является медленное введение клеток в левое полушарие головного мозга в течение пяти минут. После завершения инъекции извлеките иглу и обработайте место прокола раствором Betadine. Чтобы предотвратить рост клеток за пределами места инъекции, извлеките мышь из стереотаксической рамы и заполните отверстие предварительно нагретым костным воском.

Наконец, зашейте место разреза стерильной нейлоновой нитью 5-0. Поместите мышь в клетку с подогревом и наблюдайте за ней до полного восстановления. После восстановления введите мыши внутрибрюшинно 130 µL бупренорфина в дозе 0,1 mg/kg и дайте опухоли расти в течение 14 дней перед проведением визуализации. В день визуализации мыши запустите систему, чтобы лазеры и светодетекторы прогрелись в течение примерно 20 минут.

Чтобы избежать дрейфа и влияния чувствительности системы, установите специально разработанный линейный диффузор с углом рассеивания 100° x 4° точно по центру гентри визуализации для равномерного распределения интенсивности возбуждающих лазеров по каналам детектирования системы. Вручную отрегулируйте угол наклона диффузора таким образом, чтобы максимизировать уровень сигнала, регистрируемого всеми пятью каналами сбора света. Затем установите фильтр оптической плотности.

Два нейтральных фильтра плотности установлены перед всеми фотоэлектронными умножителями (ФЭУ), используемыми для детектирования флуоресценции и оптической плотности. Один нейтральный фильтр плотности установлен перед детектором пропускания. ФЭУ регистрируют 100 временных функций рассеяния импульса (T psfs) лазера, при этом время интегрирования для каждого лазера составляет одну секунду; затем каждая TPSF нормируется по опорному сигналу лазера с поправкой на временной дрейф этого сигнала, после чего вычисляется среднее значение по всем итерациям для каждого детектора и каждого лазера в отдельности.

Эти средние значения TPS представляют собой специфические для детектора функции инструментального отклика, используемые при реконструкции оптического изображения за 12 часов до процедуры визуализации. Введите подопытной мыши коктейль из флуоресцентных трейсеров. Наиболее сложными аспектами данной процедуры являются точная калибровка системы флуоресцентной томографии и ограничение подвижности животного.

Реконструкция изображений настолько некорректно поставлена, что даже незначительные ошибки при сборе данных могут привести к существенным погрешностям в реконструированном изображении. Чтобы обеспечить точность сбора данных, мы максимально эффективно иммобилизируем мышь и повторяем калибровку до и после сканирования, чтобы повысить вероятность получения точной калибровки. Когда всё будет готово, поместите анестезированное животное на стекловолоконные опоры стола для визуализации.

После размещения головы в носовом конусе для непрерывной газовой анестезии зафиксируйте зубы на прикусной планке и приклейте животное скотчем. Мышь должна быть расположена примерно в центре гентри системы визуализации. При позиционировании можно ориентироваться, вращая возбуждающий лазер на 180 градусов вокруг мыши, чтобы фокус лазера под всеми углами освещал точку примерно в центре тела мыши.

После правильного позиционирования осторожно перенесите предметный столик с мышью в микро-КТ сканер и соберите анатомическую информацию всего головы мыши с изотропным разрешением 93 micrometers. Просмотрите стек КТ-изображений и выберите срезы для визуализации с помощью системы флуоресцентной томографии. Осторожно перенесите предметный столик с мышью обратно в систему флуоресцентной томографии.

Выберите количество исходных позиций для каждого среза изображения, время интегрирования для каждого измерения TPSF, количество итераций для каждой позиции источника, а также положение и число необходимых срезов изображения из ранее созданного стека КТ-изображений. Затем установите фильтры перед ФЭУ детектирования флуоресценции для блокирования всего возбуждающего света и нейтральные фильтры перед ФЭУ детектирования пропускания. Чтобы избежать насыщения этих детекторов, запустите программное обеспечение для сбора данных, собирая t-PSF флуоресценции и пропускания для каждой определенной позиции источника-детектора на обеих длинах волн возбуждения.

Для каждого набора собранных T psf отслеживайте и регистрируйте интенсивность лазера с помощью референсного канала ФЭУ. Определите внешнюю поверхность тела мыши и положение ложа для визуализации. Опознайте поддерживающие стержни по CT-изображениям и создайте маски, покрывающие контуры мыши и стержня для визуализации.

Отдельно с помощью маски мыши создайте конечно-элементную сетку животного, используя программное обеспечение near fast. Локализуйте положения источников и детекторов системы флуоресцентной томографии на поверхности сетки, основываясь на координатах пространственной регистрации микро-КТ и флуоресценции. Удалите точки оптических данных, связанные с положениями источников или детекторов, которые пересекаются с местоположением ложа для визуализации.

Опорные стержни позволяют нормализовать данные, собранные в каждой позиции детекторов источников, с помощью лазерного эталона, корректируют временной дрифт лазерного эталона и учитывают чувствительность фильтров, определенную в ходе экспериментальных испытаний при покупке. Рассчитайте отношение Борна для данных каждой позиции детекторов источников и умножьте его на результат моделирования пропускания методом прямого моделирования на основе конечно-элементной сетки животного с однородными оптическими свойствами. Это выполняется для минимизации ошибок, связанных с сопряжением источника или детектора с тканью, для калибровки данных относительно модели и для корректировки данных с учетом других аспектов несоответствия данных модели. Сформируйте вектор данных, состоящий из масштабированной разности данных отношения Борна, собранных на обеих длинах волн.

Коэффициент масштабирования выбирается таким образом, чтобы максимизировать контраст связывания EGFR. Затем выполняется реконструкция изображений во временной области с использованием откалиброванных данных разности, где в качестве входных данных для каждого канала детектирования используется TPSF, после чего создаются карты флуоресценции наблюдаемого контрастно-усиленного таргетного трейсера. Ниже представлен пример реконструкции флуоресценции, наложенной на корегистрированное анатомическое КТ-изображение мыши с ортотопической глиомой U2 51. Центр масс глиомы, определенный по реконструкции флуоресценции, находился в пределах одного миллиметра от центра масс опухоли, определенного с помощью магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением.

Программное обеспечение для сбора данных разработано специально для этого устройства, однако большинство методов обработки изображений можно реализовать с помощью программного обеспечения near fasts, доступного по адресу nearfasts.org. Поэтому при выполнении данной процедуры важно убедиться, что и система, и данные точно откалиброваны перед реконструкцией изображения. Эта калибровка требует учета разности чувствительности и временных задержек между детекторами после реконструкции изображения с использованием биомаркерного таргетного трейсера.

Аналогичная визуализация с использованием нетаргетного трейсера позволяет скорректировать поглощение, не опосредованное рецепторами. Это дает возможность количественно оценить количество связанного трейсера, а также плотность рецепторов in vivo после разработки метода. Данный подход вдохновил других исследователей на создание систем флуоресцентной томографии под контролем рентгеновской визуализации и открыл путь к визуализации всего тела крупных животных.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить эксперимент по диффузионной флуоресцентной томографии, в которой объединяются системы рентгеновской анатомической визуализации и оптической визуализации для получения изображений биомаркеров рака.