Компьютерная томография наведением во временной области диффузного флуоресцентная томография у мелких животных для локализации рака биомаркеров

Общей целью данного эксперимента является получение флуоресцентных изображений экспрессии рецептора эпидермального фактора роста в мышиной модели ортотопической глиомы. Это достигается путем инокуляции левого полушария головного мозга мыши A IIC зеленым флуоресцентным белком, экспрессирующим клетки глиомы U2 51 человека. После того, как опухоль выросла в течение двух недель, мыши вводят коктейль из двух флуоресцентных индикаторов.

Затем мышь визуализируется с помощью рентгеновской системы для небольших животных для сбора анатомических данных, необходимых для точной реконструкции изображения. Данные используются для анатомического позиционирования источника и определения местоположения системы оптической томографии, а специализированное программное обеспечение используется для сбора флуоресцентных данных и создания окончательного изображения. В конечном счете, этот метод может построить изображение опухоли на основе ее сверхэкспрессии эпидермального фактора роста с использованием как флуоресцентной, так и рентгеновской визуализации, точность которой можно сравнить с магнитно-резонансной томографией с контрастным усилением.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как флуоресцентная томография мелких животных на основе зарядовой пары, заключается в том, что обнаружение подсчета одиночных фотонов с помощью фотоумножителей обеспечивает гораздо более высокую чувствительность и динамический диапазон для обнаружения света. Этот метод в конечном итоге может быть использован для мониторинга, оценки успеха молекулярной терапии путем измерения экспрессии их мишеней, в то время как подкожные опухоли легко визуализируются с помощью нетомографических методов с использованием поверхностной визуализации. Эта система предназначена для визуализации тканей толщиной до нескольких сантиметров, что делает ее особенно хорошо подходящей для визуализации, контрастирования, доставки агентов и утечки в опухоли головного мозга.

Хотя этот метод может дать представление об экспрессии биомаркеров рака, он также может быть применен к другим исследованиям заболеваний, таких как инфекция, ожирение или стареющие элементы, такие как болезнь Альцгеймера. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за диффузного характера распространения света в биологических тканях и трудности использования рентгеновской томографии для реконструкции диффузного света. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.

Поскольку этапы сбора данных и восстановления изображений могут быть сложными для освоения, важно убедиться, что данные, собранные с флуоресцентной системы, хорошо откалиброваны. Сверхбыстрый программный комплекс был разработан для считывания оптических данных и использования изображений рентгеновской томографии для создания сетки конечных элементов, которая используется в качестве пространственного шаблона для флуоресцентной реконструкции. Для начала поместите обезболенную атимическую обнаженную мышь на стерильную хирургическую простыню и подтвердите глубину анестезии, прежде чем приступить к очистке и дезинфекции кожи в области разреза.

С помощью Бетадина поместите стерильную хирургическую простыню на место разреза с помощью скальпеля, сделайте небольшой разрез немного левее средней линии и на 0,5 сантиметра позади внутриглазной линии. Очистите поверхность черепа, очистив всю соединительную ткань, чтобы можно было идентифицировать ориентиры. После того, как череп будет обнажен, используйте высокоскоростное сверло со стерильным сверлом диаметром один миллиметр, чтобы сделать отверстие, которое находится в двух миллиметрах слева от центральной линии и в двух миллиметрах позади bgma.

Зарядите шприц Hamilton Micros иглой 27 калибра с тупым концом с имплантируемыми клетками. Далее поместите мышь на стереотаксическую рамку. Затем подтвердите глубокую хирургическую и эстетическую плоскость щипцом ноги и замените операционную простыню на животном.

Далее закрепите заряженный шприц на стереотаксической раме. Расположите шприц над отверстием в черепе и введите кончик иглы на три миллиметра ниже поверхности черепа. Далее выведите иглу на один миллиметр, чтобы создать карман.

Следующим шагом является медленная инъекция клеток в левое полушарие головного мозга в течение пяти минут. После завершения инъекции извлеките иглу и промокните отверстие бетадином. Чтобы предотвратить рост клеток за пределы места инъекции, извлеките мышь из стереотаксической рамки и заполните открытое отверстие предварительно теплым костным воском.

Наконец, закройте место разреза стерильным нейлоновым швом. Верните мышь в отапливаемую клетку и наблюдайте за ней до тех пор, пока она не восстановится после выздоровления, введите мышке 130 микролитров бупренорфина IP, содержащего 0,1 миллиграмма на килограмм, и дайте опухоли расти в течение 14 дней перед визуализацией. В день визуализации с помощью мыши запустите систему, чтобы лазеры и детекторы света прогрелись в течение примерно 20 минут.

Чтобы избежать дрейфа и чувствительности системы, разместите специализированный линейный диффузор размером 100 на четыре градуса в прямом центре портала визуализации, чтобы лазеры возбуждения рассеивались по каналам обнаружения системы с одинаковой интенсивностью. Отрегулируйте угол наклона рассеивателя вручную, чтобы максимизировать количество сигнала, обнаруживаемого всеми пятью каналами сбора света. Далее место оптическая плотность.

Два фильтра нейтральной плотности перед всеми флуоресцентными фотоумножителями, называемыми ФЭУ и оптической плотностью. Один фильтр нейтральной плотности перед всеми устройствами обнаружения коэффициента пропускания. ФЭУ собирают 100 функций временного рассеяния импульсов или T psf лазера, каждая из которых имеет время интегрирования в одну секунду для каждого лазера последовательно, нормализуют каждый TPSF по лазерному эталону, корректируют временной дрейф в эталоне лазера и усредняют по всем итерациям для каждого детектора и каждого лазера в отдельности.

Эти средние TPS представляют собой специфические для детектора функции отклика прибора, используемые при реконструкции оптического изображения за 12 часов до процедуры визуализации. Введите тестовой мыши коктейль из флуоресцентных индикаторов. Точная калибровка системы флуоресцентной томографии и ограничение движений животного являются наиболее сложными аспектами этой процедуры.

Реконструкция снимка настолько некачественна, что даже незначительные ошибки при сборе данных могут привести к существенным ошибкам в реконструированном изображении. Чтобы обеспечить сбор точных данных, мы обездвиживаем мышь как можно лучше и повторяем калибровку до и после сканирования, чтобы повысить вероятность получения точной калибровки, когда она будет готова. Поместите животное под наркозом на опоры из стекловолокна кровати для визуализации.

После установки головы в носовой конус для непрерывной газовой анестезии закрепите зубы на прикусной планке и заклейте животное скотчем. Мышь должна быть размещена примерно в центре портала визуализации. Это положение может быть направлено вращением возбуждающего лазера на 180 градусов вокруг мыши, гарантируя, что фокусная точка лазера освещает точку примерно в центре мыши с точки зрения лазера под всеми углами.

После правильного расположения аккуратно перенесите визуализирующее стол и мышь к микрокомпьютерному томографу и соберите анатомическую информацию с разрешением 93 микрометра, изотропным для всей головы мыши. Визуализируйте стек изображений компьютерной томографии и выберите срезы для визуализации с помощью системы флуоресцентной томографии. Осторожно перенесите ложе для визуализации и мышь обратно в систему флуоресцентной томографии.

Выберите количество исходных позиций для каждого среза изображения, время интеграции для каждого измерения TPSF, количество итераций для каждой исходной позиции, а также положение и количество требуемых срезов изображения из ранее созданного стека изображений КТ. Затем поместите фильтры перед ФЭУ для обнаружения флуоресценции, чтобы блокировать весь возбуждающий свет и фильтры оптической плотности на фильтры нейтральной плотности перед ФЭУ с детектированием пропускания. Чтобы избежать насыщения этих детекторов, запустите программное обеспечение для сбора данных, собирающее флуоресценцию и коэффициент пропускания t psfs в каждом определенном положении детектора-источника на обеих длинах волн возбуждения.

Для каждого собранного комплекта T psfs контролируйте и записывайте интенсивность лазера с помощью опорного канала PMT. Определите внешнюю поверхность мыши и расположение места для визуализации. Поддерживайте стержни на основе изображений компьютерной томографии и создавайте маски, которые закрывают пределы мыши и стержня для визуализации.

Отдельно используйте маску мыши для создания конечно-элементной сетки животного с помощью почти быстрого программного обеспечения. Локализовать положения источника и детектора из системы флуоресцентной томографии на поверхности сетки на основе микрокомпьютерной томографии и координат флуоресцентной пространственной регистрации. Удалите оптические точки данных, связанные с положением источника или детектора, которые взаимодействуют с местоположением платформы визуализации.

Опорные стержни нормализуют данные, собранные в каждой позиции детектора источника с помощью эталона лазера, корректируют временной дрейф в эталоне лазера и корректируют чувствительность фильтра, которая была определена экспериментальными испытаниями во время покупки. Возьмите исходное соотношение данных для каждой позиции детектора источника и умножьте его с помощью прямой модели моделирования коэффициента пропускания на основе сетки животных конечных элементов для получения однородных оптических свойств. Это делается для смягчения ошибок, связанных со связью источника или детектора с тканью, для калибровки данных в соответствии с моделью и для корректировки данных с учетом других аспектов несоответствия данных модели, построения вектора данных, состоящего из масштабированной разницы данных рожденного отношения, собранных на обеих длинах волн.

Коэффициент масштабирования выбирается для максимизации контраста связывания EGFR, выполнения реконструкции изображения во временной области с откалиброванными разностными данными с использованием TPSF для каждого канала обнаружения в качестве входных данных и создания флуоресцентных карт наблюдаемого целевого трассера с усилением контраста. Ниже приведен пример флуоресцентной реконструкции, наложенной на совместно зарегистрированное анатомическое изображение компьютерной томографии мыши с опухолью ортотопической глиомы U2 51. Центр масс глиомы, определенный с помощью флуоресцентной реконструкции, находился в пределах одного миллиметра от центра масс опухоли, определенного с помощью контрастной усиленной магнитно-резонансной томографии.

Программное обеспечение для сбора данных специально разработано для этого устройства, но большинство методов обработки изображений можно выполнить с помощью программного обеспечения Near Fasts available@nearfasts.org. Поэтому, пытаясь выполнить эту процедуру, важно убедиться, что и система, и данные точно откалиброваны перед реконструкцией изображения. Эта калибровка требует, чтобы чувствительность и временные различия между детекторами учитывались с учетом последующей реконструкции изображения целевого индикатора биомаркера.

Аналогичная визуализация нецелевого индикатора обеспечивает средства коррекции нерецепторного поглощения. Это позволяет количественно определить количество связывания индикатора, а также плотность рецептора in vivo после его развития. Этот метод вдохновил других исследователей на разработку систем флуоресцентной томографии под контролем рентгеновской визуализации и проложил путь к визуализации всего тела более крупных животных.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперимент по диффузной флуоресцентной томографии, который сочетает в себе рентгеновскую анатомическую визуализацию и системы оптической визуализации для визуализации биомаркеров рака.