Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных
15 декабря 2017 г.
Целевой объект специфического датчики представляют инновационный инструмент для анализа молекулярные механизмы, такие как выражение протеина в различных типах болезни (например, воспаление, инфекция и опухолей). В этом исследовании мы описывают количественную оценку трехмерной томографических кишечных макрофагов инфильтрации в мышиных модель колита с использованием конкретного/80-F4 флуоресценции опосредованной томография.
Общая цель данного метода таргетной визуализации in vivo заключается в визуализации молекулярных маркеров активности заболевания при воспалительных заболеваниях кишечника. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области воспалительных заболеваний кишечника, а также в смежных терапевтических исследованиях влияния экспериментальных препаратов или специфических клеточных событий на воспаление. Основным преимуществом данной методики является возможность лонгитюдного и неинвазивного мониторинга активности заболевания.
Хотя этот метод позволяет получить представление о воспалительных расстройствах, его также можно применять для изучения других заболеваний, таких как рак или иммуноопосредованные заболевания. Чтобы индуцировать колит, наполните поилки подопытных мышей раствором двух граммов декстрансульфата натрия (DSS), растворенного в 100 миллилитрах автоклавированной питьевой воды, исходя из расчета пяти миллилитров воды на одну мышь в день. За 24 часа до сканирования наберите необходимый коктейль антител в стерильный шприц, защищенный от света, и введите антитела внутривенно в хвостовые вены подопытных животных.
В день проведения эксперимента сбрейте шерсть в брюшной области подопытных животных с помощью электрической бритвы, чтобы минимизировать отражение и поглощение света. Используя тканеподобный фантом определенной толщины и характеристик поглощения, заполните фантом определенным объемом исследуемого раствора антител и измерьте флуоресценцию на устройстве FMT. Затем на ветеринарном приборе для флуоресцентной томографии (FMT) для мелких животных нажмите «New Study» и укажите в описании исследования соответствующие трейсеры, включая параметры визуализации и дозы.
Сформируйте study-группы в соответствии с планом эксперимента, определив для каждой группы необходимое количество животных. После калибровки системы под используемые конструкции трассеров поместите первую анестезированную мышь в положении на спине в подогреваемую смотровую кассету с температурой 42 °C. Установите кассету в систему визуализации и выберите соответствующий образец из нужной study-группы.
Выберите введенный трейсер, чтобы обеспечить правильный расчет значений его концентрации, и получите изображение флуоресцентного отражения на соответствующей длине волны для сканирования. Нажмите Acquire Image, чтобы обозначить область сканирования и убедиться, что эта область отображается в виде наложения на изображение флуоресцентного отражения. Отрегулируйте область сканирования так, чтобы она охватывала интересующий участок, стараясь избегать ошибок или участков с остатками шерсти.
В зависимости от целевого изображения выберите разрешение поля сканирования, чтобы установить количество точек данных изображения внутри этого поля. Затем нажмите «Scan», чтобы начать получение изображения на выбранной длине волны. По завершении сканирования извлеките животное из кассеты, чтобы оно могло полностью восстановиться под наблюдением перед возвращением в клетку.
Затем процедуру FMT можно повторить в различные моменты времени, в зависимости от условий эксперимента. Для анализа полученных изображений откройте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений и выберите необработанные данные первого сканирования. С помощью инструмента реконструкции создайте 3D-карты распределения флуоресценции.
Когда все сканы будут добавлены в соответствующий набор данных для реконструкции, откройте первый интересующий вас набор данных. Будут отображены все сканы, выполненные для выбранного экспериментального животного. Выберите нужный скан и нажмите «Load» (Загрузить).
3D-реконструкция распределения трекера появится в виде наложения на изначально полученное изображение флуоресцентного отражения. Затем определите очаги неспецифического накопления метки на реконструированных 3D-картах и с помощью инструмента измерения выберите интересующую область. После этого программное обеспечение рассчитает интенсивность флуоресценции для выбранной области, а также измерит количество трекера в пикомолях, исходя из калибровки сканирования.
В данном эксперименте для прямой визуализации активированных макрофагов использовали конъюгированное с флуорофором антитело к мышиному F4/80. С помощью флуоресцентной томографии в толстых кишечниках мышей с колитом было зафиксировано значительно более высокое накопление флуоресцентного трейсера по сравнению с контрольными животными без колита, что указывает на усиление инфильтрации моноцитов и их дифференцировку в активные макрофаги у животных с колитом. Напротив, применение неспецифического конъюгированного с флуорофором антитела IgG не вызвало detectable-ответа флуоресценции в брюшной полости или кишечнике ни в группе с колитом, ни в контрольной группе без колита, что подтверждает специфичность взаимодействия зонда F4/80 с мишенью.
Измерения накопления трейсера, направленного на F4/80, ex vivo в эксплантированных толстых кишечниках дополнительно подтверждают, что сигнал от накопления трейсера F4/80, обнаруженный in vivo, исходит из толстой кишки. Действительно, рассчитанные количества связанного антитела хорошо коррелируют с гистологически определенным числом инфильтрующих макрофагов, что подтверждает возможность использования визуализации in vivo со специфическими трейсерами для оценки локальной активности заболевания. После освоения данной методики ее выполнение и анализ могут занять всего несколько минут при условии правильного проведения процедуры.
Этапы подготовки, включая создание специфических трейсеров на основе антител, обычно занимают от двух до трех дней. При планировании подобной экспериментальной процедуры важно предусмотреть подходящий и надежный контроль как для антител, так и для модели заболевания животного. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как колоноскопия или проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, а также подтвердить и количественно оценить полученные данные.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод целевой визуализации in vivo для отображения молекулярных маркеров активности заболевания при воспалительных заболеваниях кишечника. С использованием количественной трехмерной томографической оценки исследование фокусируется на инфильтрации макрофагов в кишечнике на мышиной модели колита.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Воспалительные заболевания кишечника
Теоретическое обоснование
- Мишень-специфичные зонды представляют собой инновационные инструменты для анализа молекулярных механизмов.
- Они могут быть использованы для изучения экспрессии белков при различных заболеваниях.
- Данный метод позволяет осуществлять лонгитюдный и неинвазивный мониторинг активности заболевания.
- Его можно применять при воспалительных расстройствах, раке и иммунозависимых заболеваниях.
Цель исследования
- Визуализация молекулярных маркеров активности заболевания при воспалительных заболеваниях кишечника.
- Поиск ответов на ключевые вопросы терапевтических исследований, связанных с воспалением.
- Оценка влияния экспериментальных методов лечения на воспаление.
Используемые методы
- Индукция колита с помощьюдекстрансульфата натрия (DSS).
- Внутривенное введение коктейля антител экспериментальным мышам.
- Флуоресцентная томография для визуализации инфильтрации макрофагов.
- Лонгитюдный мониторинг активности заболевания in vivo.
Основные результаты
- Успешная визуализация инфильтрации кишечника макрофагами.
- Продемонстрирована возможность неинвазивного мониторинга активности заболевания.
- Получены данные о динамике воспаления при колите.
- Определены потенциальные возможности применения метода для изучения других заболеваний.
Выводы
- Метод таргетной визуализации эффективен для изучения воспалительных заболеваний кишечника.
- Данный метод позволяет углубить понимание механизмов развития заболевания и терапевтических эффектов.
- Будущие исследования могут расширить область его применения на другие воспалительные и иммуноопосредованные заболевания.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Неинвазивная лонгитюдная визуализация инфильтрации макрофагов позволяет на ранних стадиях выявлять воспалительные реакции в доклинических моделях, снижая зависимость от терминальных точек исследования и способствуя снижению механистических рисков при разработке противовоспалительных препаратов. Количественная 3D-флуоресцентная томография обеспечивает прогностическую уверенность в связывании с мишенью и модифицирующем течение болезни эффекте, что служит основанием для принятия решений о продолжении или прекращении программ по лечению ВЗК и иммуноопосредованных заболеваний. Данный подход улучшает трансляционную преемственность путем согласования результатов визуализации in vivo с гистопатологической валидацией, оптимизируя отбор проектов в портфеле и распределение ресурсов в процессах поиска и разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации накопления F4/80-положительных макрофагов в качестве функционального показателя воспаления кишечника.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет специфического взаимодействия зонда с мишенью, что подтверждается отсутствием сигнала в контрольных группах с неспецифическими IgG.
- Прогностическая ценность: коррелирует накопление трейсера in vivo со связыванием антител ex vivo и гистологическим подсчетом макрофагов, что повышает уверенность в выборе мишени для скрининга иммуномодуляторов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные количественные 3D-карты флуоресценции и измерения концентрации трейсеров в пикомолярном диапазоне, что обеспечивает воспроизводимый скрининг соединений в моделях колита.
- Масштабируемость: облегчает лонгитюдный мониторинг в различных временных точках, сокращая количество используемых животных и повышая статистическую мощность исследований терапевтической эффективности.
- Повторное использование платформы: совместимость с последующей валидацией с помощью колоноскопии или проточной цитометрии поддерживает интегрированные рабочие процессы для валидации мишеней и сопоставления биомаркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование воспаления кишечника посредством колита, индуцированного DSS, — широко используемой системы для изучения патогенеза ВЗК и терапевтического ответа.
- Трансляционная преемственность: Связь неинвазивной визуализации с гистологическими конечными точками, что позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе согласованных данных in vivo и ex vivo.
- Снижение механистических рисков: Отслеживание инфильтрации моноцитов и динамики дифференцировки макрофагов, что дает представление о клеточных механизмах действия экспериментальных терапевтических средств.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Флуоресцентная томография занимает определенное место в континууме открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинического тестирования эффективности, особенно в случае иммуномодулирующих соединений при воспалении желудочно-кишечного тракта.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез путем количественного определения инфильтрации макрофагов в качестве фармакодинамического показателя модуляции сигнальных путей в моделях колита.
- Скрининг: Обеспечивает получение количественных данных, готовых для анализа (интенсивность флуоресценции, концентрация трейсера), что позволяет проводить сравнение между группами лечения и временными точками.
- Аналитика: Предоставляет восстанавливаемые 3D-наборы данных и измерения в выбранных областях интереса, что облегчает статистический анализ влияния терапии на локализацию иммунных клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает визуализацию in vivo с валидацией ex vivo, улучшая согласованность биомаркеров и преклиническую преемственность для кандидатов препаратов, направленных на лечение ВЗК.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемый метод визуализации, применимый для отслеживания иммунных клеток, исследований стволовых клеток и онкологических моделей, помимо воспаления кишечника.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности посредством специфической количественной визуализации активности макрофагов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет калиброванного количественного определения трейсера и лонгитюдного внутрииндивидуального отслеживания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе неинвазивного мониторинга активности заболевания, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с поправкой на риск за счет согласованности данных визуализации и гистологии, уточняя критерии продвижения в пайплайнах иммуномодуляторов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной визуализацией, приготовлением трейсеров и навыками работы с мелкими животными для проведения внутривенных инъекций и протоколов анестезии.
- Зависит от наличия системы флуоресцентной томографии для мелких животных с возможностью выбора соответствующей длины волны и программным обеспечением для реконструкции.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов визуализации, дозирования трейсеров и анализа выбранных областей интереса для согласованной интерпретации данных.
- Требуется адаптация под конкретные модельные системы, включая удаление шерсти и оптимизацию визуализации брюшной полости для минимизации помех сигнала.
- Существуют практические ограничения, такие как временной интервал подготовки трейсера (2–3 дня) и необходимость использования соответствующих изотипических контролей и контролей заболевания для обеспечения специфичности.
![Количественная оценка активности атеросклеротического налета и воспаления сосудистой помощи [18 F] фтордезоксиглюкозы позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (FDG-PET/CT)](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F3777.jpg%3Fv%3D2026-08-26T02%253A14%253A49.000Z&w=384&q=75)
