Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных

Общая цель этого целевого подхода к визуализации in vivo заключается в визуализации молекулярных маркеров активности заболевания при воспалительном заболевании кишечника. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспалительных заболеваний кишечника и связанных с ними терапевтических исследований о влиянии экспериментальных методов лечения или конкретных клеточных событий на воспаление. Основное преимущество этой методики заключается в том, что активность заболевания можно контролировать в течение длительного времени и неинвазивно.

Хотя этот метод может дать представление о воспалительных заболеваниях, он также может быть применен для изучения других заболеваний, таких как рак или заболевания, связанные с иммунитетом. Чтобы вызвать колит, наполните питьевой запас подопытных мышей двумя граммами сульфата натрия декстрана, или DSS, растворенного в 100 миллилитрах автоклавированной питьевой воды, что составляет пять миллилитров воды на мышь в день. За 24 часа до сканирования загрузите интересующий коктейль антител в стерильный шприц, защищенный от света, и введите антитела внутривенно в хвостовые вены экспериментальных животных.

В день эксперимента используйте электрическую бритву, чтобы сбрить шерсть в области живота подопытных животных, чтобы свести к минимуму отражение и поглощение света. Используя тканеимитирующий фантом определенной толщины и абсорбционных характеристик, заполните фантом определенным объемом исследуемого раствора антитела и измерьте флуоресценцию на устройстве FMT. Затем на ветеринарном флуоресцентно-опосредованном томографе или устройстве FMT для мелких животных нажмите «Новое исследование» и включите соответствующие индикаторы в описание исследования, включая параметры визуализации и дозы.

Создание учебных групп в соответствии с планом эксперимента, оснащение каждой группы соответствующим количеством животных. Когда система будет откалибрована для использования с индикаторными конструкциями, поместите первую мышь, находящуюся под наркозом, в лежачую на спине кассету для осмотра с температурой 42 градуса Цельсия. Вставьте кассету в систему визуализации и выберите подходящий образец из соответствующей исследуемой группы.

Выберите введенный индикатор, чтобы убедиться, что значения концентрации индикатора рассчитаны правильно, и получить изображение отражения флуоресценции на соответствующей длине волны для сканирования. Нажмите кнопку Получить изображение, чтобы очертить поле сканирования и убедиться, что поле сканирования отображается как наложение на изображение флуоресцентного отражения. Отрегулируйте поле сканирования так, чтобы оно окружало интересующую область, стараясь избежать ошибок или участков оставшейся шерсти.

В зависимости от цели изображения выберите разрешение поля сканирования, чтобы задать количество точек данных изображения в поле сканирования. Затем нажмите кнопку Сканировать, чтобы начать получение изображения на выбранной длине волны. В конце сканирования извлеките животное из кассеты, чтобы животное полностью восстановилось под наблюдением, прежде чем вернуться в клетку.

Затем ТФМ может быть повторена в различные моменты времени в зависимости от того, насколько это целесообразно с экспериментальной точки зрения. Чтобы проанализировать полученные изображения, откройте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений и выберите исходные данные для первого сканирования. С помощью инструмента реконструкции создайте 3D-карты распределения флуоресценции.

Когда все сканы будут добавлены в соответствующий набор данных реконструкции, откройте первый интересующий вас набор данных. Будут показаны все сканирования, выполненные для выбранного отдельного экспериментального животного. Выберите подходящий скан и нажмите кнопку Загрузить.

3D-реконструкция распределения индикаторов будет выглядеть как наложение первоначально полученного изображения флуоресцентного отражения. Далее определите очаги скопления неспецифических надписей на восстановленных 3D-картах и с помощью измерительного инструмента выберите интересующую область. Затем программное обеспечение сгенерирует интенсивность флуоресценции для интересующей области, а также измерит пикомолярное количество индикатора, для которого было откалибровано сканирование.

В этом эксперименте флуоресцентное конъюгированное антитело против мышиного F4/80 было использовано для непосредственной визуализации активированных макрофагов. С помощью флуоресцентно-опосредованной томографии в толстой кишке мышей с колитиками было измерено значительно повышенное накопление флуоресцентного индикатора по сравнению с контрольными животными без колитов, что указывает на увеличение инфильтрации моноцитов и дифференцировки в активные макрофаги у животных с колитикой. И наоборот, применение неспецифического флуоресцентного конъюгированного антитела IgG не нарушало обнаруживаемого флуоресцентного ответа в брюшной полости или кишечнике ни в колитической, ни в неколитической контрольной группе, демонстрируя специфичность зонд-мишенного взаимодействия антитела F4/80.

Измерения ex vivo накопления F4/80-направленного индикатора в эксплантированных толстых кишках дополнительно подтверждают колоническое происхождение обнаруженного in vivo сигнала индикатора F4/80. Действительно, расчетное количество связанного антитела хорошо коррелирует с гистологически определенным числом инфильтрирующих макрофагов, подтверждая, что визуализация in vivo с помощью специфических индикаторов может указывать на местную активность заболевания. После того, как вы освоите это, это можно выполнить и проанализировать в течение пары минут, если это сделано правильно.

Этапы подготовки, включая производство специфических индикаторов на основе антител, обычно занимают два-три дня. При планировании экспериментальной процедуры, подобной этой, важно включить в нее надлежащие и надежные меры контроля, как для антител, так и для модели болезни животных. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как колоноскопия или проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, а также проверить и количественно оценить данные.