Экспертиза тимуса позитивной и негативной селекции с помощью проточной цитометрии

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы изучить развитие мышей с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем приготовления одноклеточных суспензий из мыши, тимуса и селезенки. В качестве второго шага тимоциты и циты окрашиваются коктейлем антител для идентификации конкретных популяций THY.

В конечном счете, частота и количество различных популяций лимфоцитов могут быть оценены с помощью проточного цитометрического анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в развитии Т-клеток, например, какие гены и пути важны для создания функционального, но толерантного к клеткам репертуара Т-клеток. Хотя этот метод может дать представление о развитии Т-клеток в тимусе, он также может быть применен для изучения развития других иммунных клеток.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности при разработке коктейлей антител для проточной цитометрии. Перед началом вскрытия поместите стерильное стальное сетчатое сито в чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров. Затем добавьте в блюдо пять миллилитров HBSS и храните блюдо на льду, чтобы собрать тимус.

Сначала с помощью пары щипцов приподнимите нижний кончик грудины и обнажите диафрагму. Затем, избегая печени, разрежьте диафрагму, чтобы отделить грудную клетку, а затем разрежьте грудную клетку вверх с каждой стороны. Будьте осторожны, чтобы избежать легких и сердца.

Теперь с помощью щипцов аккуратно оттяните грудную клетку назад. Тимус – это белый двудольный орган, расположенный над сердцем. Используйте плоский край щипцов, чтобы захватить нижнюю часть мочек.

Затем аккуратно вытащите тимус и поместите его на одно из заранее подготовленных сетчатых сит. Чтобы собрать селезенку, сделайте разрез через брюшину, чтобы обнажить брюшную полость. Селезенка — это орган в форме красной доски для серфинга, расположенный на левой стороне брюшной полости мыши ниже печени.

Затем используйте одну пару щипцов, чтобы вытащить селезенку, а другую — чтобы удалить соединительную ткань. Затем поместите рассеченную селезенку на отдельное сетчатое сито. Теперь с помощью поршня из трехмиллилитрового шприца измельчите каждый орган в его сетчатое сито, пока не останется только соединительная ткань и жир, пипетки клеток и HBSS в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Затем промойте каждую сетку свежим HBS S3 раза. Затем гранулируйте клетки в течение пяти минут при температуре 335 раз G и четырех градусах Цельсия. После аспирации надосадочной жидкости суспендируйте циты в 500 микролитрах буфера для лизиса CK на 10 минут при комнатной температуре, в то время как эритроциты селезенки находятся под действием Resus.

Приостановите тимоциты в соотношении 20 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр в буфер факса и отложить их на лед. Теперь добавьте пять миллилитров HBSS, чтобы вернуть цитам изотоничность после повторного вращения клеток, восстановите суспендию свободной гранулы эритроцитов в соотношении 20 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр в буфере факса. Начните этот шаг с Али Уоттинга.

Четыре раза по 10 до шестой части зарезервированных тимоцитов на образец проточной цитометрии в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем добавьте циты в лунки 96-луночного планшета для контроля компенсации. Затем заблокируйте рецепторы FC в каждом из образцов клеток путем инкубации с анти-CD 1632 в течение 10 минут на льду.

Теперь поверните пластину вниз, а затем рассейте жидкость из лунок, бросив пластину лицевой стороной вниз в раковину, затем восстановите суспензию каждой лунки в 200 микролитрах факс-буфера и повторите промывку. Затем инкубируйте экспериментальные образцы с 200 микролитрами коктейля антител или одиночными конъюгированными антителами с флуорохромом для компенсационного контроля. Все в буфере факса на льду в темноте.

Через 30 минут дважды промойте клетки факс-буфером, а затем после суспензии клеток в факс-буфере перенесите образцы в факсимильные пробирки в физиологических трансгенных моделях TCR и мышах дикого типа. Положительный отбор начинается с двойной положительной яркой стадии, а затем переходит в двойную положительную тусклую стадию. После того, как антиген сталкивается с двойным положительным тусклым тимоцитом, затем вступают в переходную четвертую положительную CD восьмую низкую стадию, прежде чем перейти в CD четыре.

Одиночные положительные или CD восемь одиночных положительных тимоцитов зрелые одиночные положительные тимоциты характеризуются высокой экспрессией TCR и потерей CD 24. В то время как профиль CD восемь на CD 4 может выявить дефекты в положительном отборе, изучение TCR бета по CD 69 или CD 5 может дать более глубокое понимание того, где находится дефект. Как CD 69, так и CD 5 активируются после стимуляции TCR с более сильными взаимодействиями, приводящими к более высокой экспрессии этих маркеров.

На этом графике TCR beta by CD 69 у мышей дикого типа, отрицательная походка TCR R R beta с низким CD 69 представляет собой популяцию тимоцитов с двойным положительным результатом предварительного отбора. В то время как этот TCR бета промежуточный CD 69 положительная походка представляет собой переходную популяцию сразу после вовлечения TCR и состоит из двойного положительного яркого с некоторыми двойными положительными тусклыми и CD четырех положительных CD с восемью низкими клетками. Здесь TCR R бета высокий CD 69 положительная походка иллюстрирует популяцию клеток непосредственно после положительного отбора, которые состоят из двойных положительных тупых CD четырех положительных, CD восьми низких и CD четырех одиночных положительных клеток.

Наконец, эта отрицательная походка TCR beta с высоким уровнем CD 69 показывает более зрелую популяцию клеток, которая в основном состоит из CD 4 и CD 8 одиночных положительных клеток. Отсутствие промежуточного CD 69-положительного и TCR R бета бета-положительного CD 69-положительного уровня может свидетельствовать об ухудшении изменений положительного отбора в соотношении CD четыре одиночных положительных к CD восемь. Одиночные положительные клетки в популяции TCR beta с высоким CD 69 отрицательным может указывать на изменения в приверженности линии.

Потеря TCR бета с высоким CD 69 положительным и TCR бета с высоким CD 69 отрицательным может отражать проблемы с выживаемостью после положительного отбора. Изучение TCR beta с помощью CD 5 является еще одной стратегией для выявления популяций до и после положительного отбора. Эти первые две популяции состоят в основном из двойных положительных ярких тимоцитов.

Популяция TCR beta low CD five low представляет собой двойную положительную популяцию тимоцитов до отбора, а промежуточная популяция TCR beta intermediate CD five состоит из клеток, которые инициируют положительный отбор. Нарушенное поколение этой или предыдущей популяции свидетельствует о дефектном положительном отборе. Тем не менее, TCR R beta промежуточный CD 5 high популяция представляет тимоциты, находящиеся в процессе положительного отбора, и состоит в основном из двойных положительных тупых и CD четырех положительных.

CD восемь тимоцитов с низким уровнем тимоцитов. Популяция TCR beta high CD five high состоит в основном из постположительного отбора. Одиночные положительные тимоциты изменяются в соотношении CD четыре, одиночные положительные к CD 8.

Одиночные положительные клетки в этой популяции, несмотря на нормальные предшествующие популяции, могут указывать на изменения в приверженности линии. Кроме того, отсутствие этой популяции может указывать на снижение выживаемости тимоцитов после положительного отбора, поскольку отрицательный отбор включает в себя делецию небольших антиген-специфических популяций. Дефекты в этом процессе лучше всего наблюдаются на трансгенных мышах TCR в HY CD четырех мышей, тимоциты, экспрессирующие трансгенный H-Y-T-C-R, могут быть обнаружены с помощью моноклонального антитела T 3.7.

H-Y-T-C-R распознает мужской специфический антиген HY, представленный в MHC Class one db. Таким образом, у четырех мышей мужского пола HY CD происходит отрицательный отбор H-Y-T-C-R положительных тимоцитов, на что указывает снижение T 3,7 положительных двойных положительных THYMOCITES и более резкое снижение T 3,7 положительного CD восьми, одиночных положительных показателей THY. В отличие от этого, четыре самки мышей HY CD проходят положительный отбор для получения T 3,7 положительных CD и восьми одиночных положительных Т-клеток.

В то время как уменьшение числа двукратных положительных тимоцитов указывает на отрицательный отбор, отсутствие антиген-специфических одиночных положительных тимоцитов является наиболее точным показателем. Дальнейшее изучение нескольких Т-3-целых 70-положительных CD-восьми одиночных положительных тимоцитов у четырех самцов мышей HY CD показало, что большинство из них являются высоконезрелыми клетками CD-24. В то время как большинство Т три целых 70 положительных CD восемь одиночных положительных тимоцитов в HY CD четыре самки достигли зрелости и имеют низкий CD 24, что обеспечивает дополнительную поддержку того, что отрицательный отбор происходит у HY CD четырех самцов мышей.

Одним из предостережений трансгенных моделей TCR является то, что трудно дополнительно охарактеризовать положительный отбор путем идентификации популяций на основе экспрессии TCR и CD 69 или CD 5 из-за высокой экспрессии TCR на протяжении всего развития CYTE. Как показывает увеличение положительной популяции CD 69 по сравнению с диким типом, отрицательный отбор включает в себя более высокий стимул TCR сродства, чем положительный отбор. На это указывает более высокая экспрессия CD 69 на Т-трех точках 70 положительных двойных положительных тимоцитах у HY CD четырех мышей-самцов, что приводит к смещению пика гистограммы вправо.

Аналогичные тенденции наблюдаются и с экспрессией CD 5 при анализе отбора тимуса у генетически модифицированных мышей. Изучение экспрессии CD 69 или CD 5 может определить, связан ли дефект с передачей сигналов TCR или с последующим результатом стимуляции TCR. После освоения эта техника может быть выполнена за два с половиной часа для подготовки клеток и окрашивания, плюс еще один час для сбора данных на проточном цитометре.

При правильном выполнении каждая дополнительная мышь будет добавлять примерно 30 минут. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с тимоцитами и убедиться, что вы заранее спланировали стратегию окрашивания. Следуя этой процедуре.

Другие анализы, такие как анализы на убийство или выработку цитокинов, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, функционируют ли экспортируемые тимоциты должным образом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как анализировать развитие сайта тимуса с помощью проточной цитометрии.