Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

Общей целью этой процедуры является выделение, идентификация и очистка эпителиальных клеток тимуса или технологий. Это достигается путем ферментативного переваривания и механического разрушения тимуса с целью диссоциации технологии в одноклеточную суспензию. Затем технология может быть проанализирована с помощью проточной цитометрии или обогащена с помощью стратегии панорамирования.

В конечном счете, субпопуляции эпителия тимуса могут быть очищены путем сортировки флуоресцентно активированных клеток. Этот метод может помочь ответить на многие ключевые вопросы в области развития Т-клеток, например, как эпителиальные клетки тимуса способствуют отбору тимуса? Что вызывает дисфункцию тимуса у стареющих животных и как мы можем добиться восстановления Т-клеток in vitro?

Основными преимуществами этого метода являются высокое восстановление вариабельных эммических гермических клеток, несмещенное обогащение эммических эпителиальных клеток и высокая чистота, которая в конечном итоге может быть достигнута с помощью сортировки клеток. Чтобы выделить стромальные клетки тимуса, сначала определите тимус, который находится прямо под ребрами и выглядит как две тонкие белые доли, расположенные над сердцем. Затем отсоедините соединительную ткань, окружающую тимус, и с помощью изогнутых зубчатых щипцов аккуратно потяните и удалите доли тимуса.

Поместите доли в шестилуночную пластину, содержащую пять миллилитров среднего объема, и обрежьте весь окружающий жир и соединительную ткань. Затем переложите подстриженные доли в новую лунку, содержащую пять миллилитров свежеприготовленного ферментного раствора и с помощью тонких ножниц сделайте небольшие надрезы в ткани. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию.

Через 20 минут аккуратно несколько раз пипетируйте ткань вверх и вниз пятимиллилитровой пипеткой, чтобы диссоциировать суспензию в одноклеточную суспензию. Соберите надосадочную фракцию в 50 миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров холодного буфера, богатого альбумином, на льду для нейтрализации ферментов. Затем добавьте 2,5 миллилитра ферментного раствора в оставшуюся ткань.

Выдержите тарелку в течение 15 минут. После этого аккуратно взбалтывают ткань трехмиллилитровым шприцем, оснащенным иглой 18 гена, чтобы разбить любые агрегаты. Затем переложите в пробирку для сбора.

Затем добавьте 2,5 миллилитра ферментного раствора в оставшуюся ткань. Выдержите тарелку в течение 15 минут. После третьей инкубации повторите механическое перемешивание иглой 20 5G.

После инкубации ткани в течение последних пяти-10 минут перенесите надосадочную жидкость в пробирку для сбора для центрифугирования, чтобы идентифицировать восстановленную технологию с помощью проточной цитометрии. Во-первых, инкубируйте клетки с соответствующими антителами для обогащения. Затем добавьте клеточную суспензию в предварительно закодированную проволочную пластину, а затем переверните пластину и инкубируйте при комнатной температуре.

Через 30 минут энергично покрутите пластину, а затем перенесите надосадочную жидкость в коническую трубку. Ополосните пластину два раза свежим, средним, скапливая смывки в сборной трубке. Затем, после вращения клеток, повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах свежей среды и перенесите клеточную суспензию на новую пластину для промывки, собирая клетки после закручивания и инкубации, как только что было продемонстрировано, для дальнейшей очистки обогащенной технологии в их подмножествах клеток тимуса.

После мечения соответствующими антителами отсортируйте технологию через 100-микрометровую насадку методом сортировки флуоресцентно активированных клеток, собирая клетки в объеме 30% объема FBS в среде. В этой репрезентативной стратегии гейтирования для идентификации технологии с помощью проточной цитометрии можно наблюдать экспрессию epca, но не CD 45 с помощью технологии. Таким образом, технологии могут быть забиты в соответствии с их экспрессией EP, camm и CD 45 Технология состоит из корковых или CEC и медуллярных или mtech подмножеств тимического эпителия.

Эти субпопуляции можно различить по живому антителу 51, которое распознает G-глутамиламинопептидазу, экспрессируемую ctec, и лектину UEA, которое связывается с mtech как ctech, так и Mtech express MHC Class 2 на их поверхностях. Несмотря на то, что mtech можно далее классифицировать на популяции с низким и высоким уровнем mtech, в зависимости от уровня экспрессии MHC two, примерно в восемь раз больше технологий может быть восстановлено с использованием только что продемонстрированного протокола на основе фермента лиазы по сравнению с протоколом с коллагеназой и дисковым пространством примерно в девять раз 10 до пятой, что может быть восстановлено всего из одного тимуса мыши, чтобы сократить время сортировки и повысить жизнеспособность восстановленные стромальные клетки. Промывка может быть использована, как только что продемонстрировано, для истощения участков тимоцитов по сравнению с цельными подготовленными клетками тимуса.

Доля технологий увеличивается с менее чем 0,5% до более чем 15% в популяции клеток после обогащения. После панорамирования пропорции технологических подмножеств не изменяются, что позволяет предположить, что ни одно из подмножеств не теряется выборочно во время панорамирования. По сравнению с образцом для обогащения прееном, скорость восстановления технологии составляет около 85%После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как обогатить темические половые клетки от более чем панических клеток, а также как идентифицировать и очистить более темические эпителиальные просадки с помощью проточной цитометрии.