₁ F _O АТФазы Подготовка пузырька и техника исполнительских патч зажим Записи субмитохондриальных мембран везикул

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать везикулы F1 F с нулевым содержанием APA из мозга крысы для выполнения записи с помощью патч-фикса. Это достигается путем удаления мозга у крысы и его гомогенизации. Второй шаг — нарушить синаптические зоны путем надавливания.

Затем синаптосомы наслаиваются на градиенты флакона. Заключительным этапом является инкубация с Digit toin и L для получения окончательных пузырьков для записи с помощью патч-клэмпа. Важной функцией митохондрий является производство ТП путем окислительного фосфорилирования.

Ферментом, ответственным за выработку TP, является A TP-синтаза, расположенная на внутренней мембране митохондрий. Чтобы детально изучить функцию A TP синтазы, мы выделяем специальные субмитохондриальные везикулы, которые мы называем SMV. Они содержат фермент синтазу A TP в конфигурации «изнутри наружу».

Затем мы регистрируем эти SMV с помощью патч-зажимного электрода и определяем негерметичность их мембраны. Это говорит нам об эффективности производства ТП митохондриями. Сегодня эту процедуру будет демонстрировать Сильвия Ти, научный сотрудник моей лаборатории в Йельском университете.

В этой процедуре, после получения головы крысы путем обезглавливания, разрежьте кожу, чтобы обнажить череп, затем осторожно вскройте череп, разрезав его ножницами или ронами. Затем удалите мозг, измельчите мозг без мозжечка окончательно в изоляции, буферизуйте, затем переложите его в пятимиллилитровый стеклянный тефлоновый гомогенизатор, аккуратно гомогенизируйте ткань 10 раз, примерно пять минут в общей сложности. После этого центрифугируйте образец при 1,500 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в настольной центрифуге.

Сохраните надосадочную жидкость с митохондриями и синаптосомой и выбросьте гранулу. Затем снова центрифугируйте его при 16 000 перегрузках в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в настольной центрифуге. Затем отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте небо В 500 микролитрах изоляционного буфера нарушите синаптосому с сосудом для разрушения клеток, применяя давление 1,200 PSI в течение 10 минут, с последующей быстрой декомпрессией слоя нарушенных зон синапа на центрифужные пробирки с двумя различными концентрациями флакона, которые образуют два слоя.

Затем поместите пробирки в ротор SW 50.1 и центрифугируйте при температуре 126, 500 раз больше G на 20 минут при четырех градусах Цельсия. В ультрацентрифуге нёбо — это очищенные митохондрии. Слой между различными плотностями фиала — это ненарушенная синаптосома.

После этого промойте гранулу центрифугированием в изоляции. Буферизируйте при 16 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в настольной центрифуге. Теперь Resus, суспендируйте митохондрии в 200 микролитрах изоляционного буфера, объединенного с равным объемом 1% тоина.

Поместите его на лед на 15 минут. Затем добавьте еще изоляцию, буфер и центрифугуйте при 16 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Повторите эту процедуру дважды, затем снова суспендируйте нёбо в 200 микролитрах изоляционного буфера, и добавьте два микролитра 10%Lu бюстгальтера, PX, перемешайте и положите на лед на 15 минут.

После этого выложите смесь слоями изолированно, буферизуйте в пробирках центрифуги. Поместите пробирки в ротор SSW 50.1 и центрифугируйте его при температуре 182 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа. Через час.

Вымойте окончательную палитру, центрифугируя ее в изоляционном буфере при 16 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Типичная электрофизиологическая установка включает в себя усилитель, компьютер ПК, оснащенный цифровым преобразователем данных 1, 440, интерфейс аналого-цифрового преобразователя в сочетании с P-зажимом, программные манипуляторы 10.0, микроскоп, виброизоляционный стол и клетку Фарадея. Сначала вытащите пипетку из капиллярной трубки из силикатного стекла Бороса в пылающе-коричневом микропипетке.

Оптимальное сопротивление пипетки должно составлять от 80 до 100 мегаом. Добавьте субмитохондриальные везикулы в физиологический внутриклеточный раствор. Затем наполните этим же раствором патч-хомут пипетку.

Визуализируйте везикулы под фазовым контрастом. Микроскопия после наложения СМВ при комнатной температуре. Запишите активность при поддержании мембранного потенциала на уровне напряжения в диапазоне от отрицательных 100 мВольт до положительных 100 мН в течение 10 секунд каждый период.

Записанные данные фильтруются с частотой пять килогерц с помощью схемы усилителя и анализируются с помощью программного обеспечения clamp fit 10.0. На этом рисунке показан блоттинг лизата, приготовленного из цитозоля и митохондрий. На верхней панели показан иммуноблоттинг с использованием антитела против цитозольного белка GA dh.

На нижней панели показан блоттинг с использованием антитела против белка внутренней мембраны митохондрий. Кокс четвертый: Вот две типичные записи патч-зажимов до и после добавления одного миллимоляра TP. Удерживающий потенциал положительный: 70 милливольт. Пунктирная линия представляет собой ноль пикоампер.

Каждая трассировка записывается в течение 10 секунд, а между трассировками и отображением проходит 10 секунд. Вот примеры изменений интенсивности флуоресценции индикатора A CMA с течением времени в присутствии SMV, а также при отсутствии и присутствии TP. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать митохондрии, субмитохондриальные везикулы, содержащие синтез F1 FO 80 TP. Кроме того, следует разобраться в форме I резистентного уплотнения с электродом на мембране везикулы для анализа активности канала комплекса A TP Syntase.