Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток
10 сентября 2013 г.
Мы разработали неповрежденный мозг спинной подготовку шнур для записи и мониторинга электрической активности с помощью записи зажим патч от нейронов Mauthner и других ретикулоспинальных клеток в эмбрионы рыбок данио. Таким образом, мы можем записать возбуждающих и тормозных синаптических токов, активность канала напряжения закрытого и потенциалы действия от ключевых нейронов в развивающемся эмбрионе.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать синаптические свойства и свойства возбудимости эмбриональных рыб данио-рерио в своих клетках. Это достигается путем предварительного препарирования эмбриона рыбы данио, чтобы обнажить вентральную поверхность заднего мозга. Второй шаг заключается в том, чтобы поместить препарированный препарат на предметное столико для патч-хомута микроскопа и идентифицировать ротовую полость в их клетках.
Следующий патч. Закрепите М-клетки в соответствующем режиме записи и запишите синаптическую активность и свойства возбудимости. Последним шагом является анализ записанных данных для выяснения синаптических или возбудимых свойств.
В конечном счете, зажатие пластыря из этих клеток используется для демонстрации свойств синаптических рецепторов в развивающемся организме. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, сталкиваются с двумя основными трудностями. Первый – это вскрытие.
Второе формирование концертной сцены может быть сложным. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я решил работать над препаратом для рыбок данио, в котором задний мозг был прикреплен к спинному мозгу, демонстрируя процедуру с помощью Буррама Роя, аспиранта моей лаборатории. Сначала закрепите шайбы на горке с помощью смазки.
Затем добавьте жидкую сарду в центр шайбы. Сарда обычно затвердевает за ночь и образует небольшую круглую подстилку на предметном стекле, которая становится основанием анатомической чашки. После того, как на предметное стекло будет наложен защитный листок, поместите предметное стекло в записывающую камеру, которая будет служить основанием для вскрытия.
После этого приготовьте необходимые растворы. Внеклеточные растворы следует оставлять при комнатной температуре, в то время как внутриклеточные растворы должны храниться стерильно. Можно также добавить 0,1% сыпучего для желтого цвета во внутриклеточный раствор, чтобы в конце эксперимента можно было провести визуализацию морфологии М-клеток для подтверждения идентичности клеток.
Затем вырастите эмбрионы рыбы данио дикого типа в яичной воде при температуре 28,5 градусов Цельсия, соберите и разместите в соответствии с предыдущей публикацией. Для вскрытия эмбрионы переносят в чашку для препарирования, которая также служит камерой для регистрации. Затем обезболивайте их в течение семи-10 минут.
В обезболивающем солевом растворе, который очень близок к физиологическому раствору, можно определить, адекватно ли он обезболился, изучив реакцию на легкое пощипывание хвоста. После этого прикрепите эмбрионы к чашке SIL с помощью вольфрамовой проволоки диаметром 0,001 дюйма под препарирующим микроскопом с 25-кратным увеличением. Отрегулируйте увеличение на препарирующем эндоскопе до 40-50 раз, чтобы выполнить рассечение.
Теперь удалите челюсть, глаза и передний мозг с помощью тонких щипцов. Аккуратно отделите задний мозг от подлежащего узлового канатика, осторожно прорабатывая щипцами между узловым канатиком и мозгом. Затем аккуратно переверните задний мозг так, чтобы брюшная поверхность была обращена вверх.
Такое расположение обеспечивает хороший доступ к М-клеткам, которые обычно находятся в пределах от 5 до 10 микрометров от вентральной поверхности у молодых эмбрионов и от 20 до 50 микрометров у более старых личинок. Затем осторожно переместите препарат в установку записи, где можно провести эксперимент с патч-клэмпом. М-ячейки визуализируются с помощью дифференциального интерференционного контраста, хотя для подготовки к зажиму патчей могут использоваться и другие режимы визуализации.
Начните с вытягивания нескольких патч-пипеток CLA с тонкостенным босиликатным стеклом. В горизонтальном дозаторе диаметр наконечника составляет от 0,2 до 0,4 микрометра после огневой полировки до гладкого края, а длина конуса хвостовика составляет около четырех миллиметров. Заполните наконечник пипетки внутриклеточным раствором, погрузив наконечник во внутриклеточную жидкость.
Затем вставьте иглу шприца в пипетку и аккуратно вытолкните из шприца внутриклеточный раствор. Чтобы завершить наполнение пипетки, прикрепите пипетку к головному столику усилителя В электрофизиологической установке важно, чтобы головной столик находился под углом примерно 45 градусов к горизонтальной оси, так как это обеспечивает угол входа пипетки, подходящий для образования высокопрочных уплотнений с ртом в их ячейке непосредственно перед тем, как пипетка опустится в раствор для ванны. Надавите на пипетку с небольшим положительным давлением, чтобы снизить вероятность блокировки наконечника. Продолжайте приближаться к М-клетке с небольшим положительным давлением в пипетке.
Положительное давление мягко толкает клетку из стороны в сторону, и при непосредственном расположении над клеткой образует небольшую ямочку на клеточной мембране. Теперь оставьте пипетку на месте на несколько секунд, чтобы аккуратно очистить поверхность клетки, чтобы между пипеткой и мембраной образовалось прочное уплотнение. Затем сбросьте положительное давление в пипетке, чтобы начать запечатывание.
Небольшое отрицательное давление в сочетании с отрицательным потенциалом пипетки приводит к образованию гига-уплотнений в течение нескольких секунд. Впоследствии измените удерживающий потенциал в усилителе на минус 60 милливольт. Разорвите клеточную мембрану серией коротких импульсов всасывания.
Затем немедленно регистрируются мембранные потенциалы и минимизируются артефакты емкости. Компенсация емкости ячейки и сопротивления доступа на 70–85% Сопротивление доступа следует контролировать каждые 30 секунд или минуту, и при изменении на 20% или более прервать эксперимент. Как только эксперимент закончится и будет получено достаточно данных, пожертвуйте эмбрионом, удалив задний мозг с помощью пары щипцов.
На этом рисунке представлены репрезентативные записи возбуждающих токов A MPA и NMDA, полученных от 48 эмбрионов HPF. Вот спонтанные A MPA ME PSC, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом минус 60 мВ. А это средние МП ЧОП.
Вот спонтанные A MPA и NMDA me PSC, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом 40 милливольт. И это средний показатель МЭ ПСК глутамата МЕ, ПСК были зарегистрированы в присутствии одного микромолярного ТТХ для блокирования потенциалов действия, пяти микромолярных строгих девяти и 100 микромолярного ритоксина для блокирования глицина и появления G. Вот спонтанные ЧПК ИМ, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом минус 60 милливольт.
А средние ОС ПСК ИМ Им регистрировались при наличии одного микромолярного ТТХ для блокирования потенциалов действия. Одна миллимолярная химерная кислота блокирует активность глутаматных рецепторов и 10 микромоляров Цин блокирует возникновение ГАМК. Это потенциалы действия, регистрируемые М-клеткой в этой конкретной клетке.
Пороговый стимул SRA в 0,48 наноампера вызывает несколько потенциалов действия, но стимул к пороговому значению приводит только к образованию одного потенциала действия. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-четыре часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как залатать зажимную запись из М-клеток и других ретикулярных спинномозговых нейронов у эмбрионов рыбок данио.
Обзор
В данном исследовании представлен метод регистрации электрической активности нейронов Маутнера и ретикулоспинальных клеток эмбрионов zebrafish с использованием интактного препарата головного и спинного мозга. Данная методика позволяет анализировать синаптические токи, активность потенциал-зависимых каналов и потенциалы действия в развивающихся нейронах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Электрофизиология
- Биология развития
Теоретические сведения
- Эмбрионы данио-рерио представляют большую ценность для изучения развития нейронов.
- Нейроны Маутнера играют критическую роль в реакции избегания.
- Методы патч-клампа необходимы для исследования синаптических свойств.
- Понимание синаптической активности имеет решающее значение для получения данных о нейронных цепях.
Цель исследования
- Разработать надежный метод регистрации нейронной активности в эмбрионах zebrafish.
- Исследовать возбуждающие и тормозные синаптические токи в ключевых нейронах.
- Проанализировать свойства синаптических рецепторов в процессе эмбрионального развития.
Используемые методы
- Диссекция эмбрионов данио-рерио для обнажения заднего мозга.
- Использование патч-кламп микроскопии для регистрации активности нейронов Маутнера.
- Применение специфических растворов для внутриклеточной и внеклеточной среды.
- Анализ данных для определения синаптических свойств и свойств возбудимости.
Основные результаты
- Успешная запись возбуждающих и тормозных синаптических токов.
- Характеристика активности потенциалзависимых каналов в развивающихся нейронах.
- Определение свойств синаптических рецепторов у эмбрионов zebrafish.
- Демонстрация эффективности метода для будущих электрофизиологических исследований.
Выводы
- Разработанный метод эффективен для изучения нейронной активности в эмбрионах zebrafish.
- Полученные данные могут углубить понимание развития нервной системы.
- Данный подход может способствовать дальнейшим исследованиям синаптических механизмов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Регистрация методом патч-кламп с клеток Маутнера эмбрионов zebrafish позволяет напрямую измерять функцию синаптических рецепторов в развивающейся нервной системе позвоночных. Данный подход способствует валидации мишеней, предоставляя количественные данные о возбуждающей и тормозной нейротрансмиссии в критические периоды нейроразвития. Препарат из неповрежденного мозга и спинного мозга сохраняет нативные нейронные цепи, что повышает прогностическую достоверность механистических исследований синаптической пластичности и фармакологии рецепторов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем измерения возбуждающих токов, опосредованных AMPA- и NMDA-рецепторами, и тормозных токов, опосредованных GABA/глицином, в развивающихся клетках Маунтнера.
- Практическая ценность: Снижение биологических рисков за счет функциональной валидации экспрессии и активности синаптических рецепторов в нативном клеточном контексте.
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет отслеживания синаптического развития на уровне отдельных клеток в различных препаратах, что снижает вариабельность механистических интерпретаций.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов исследования путем установления базовых амплитуд и кинетики синаптических токов в эмбриональных нейронах.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования единообразных протоколов диссекции, регистрации и анализа, позволяющих сохранить функциональные синаптические связи.
- Научная ценность: Подтверждение готовности платформы к скринингу и возможности ее повторного использования путем обеспечения доступа к одному и тому же типу клеток (клетке Маунтнера) в разных препаратах для лонгитюдных исследований развития синапсов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждение значимости заболевания и согласования трансляционных биомаркеров путем установления связи между измерениями синаптического тока и процессами нейроразвития, имеющими значение для моделей неврологических расстройств.
- Операционная ценность: Описание преемственности от этапа открытия до доклинической валидации с использованием эмбрионов zebrafish в качестве релевантной модели заболевания для исследований по изучению взаимодействия с мишенью на ранних стадиях.
- Научная ценность: Акцент на прогностической ценности по снижению рисков путем характеристики активности потенциал-зависимых каналов и свойств синаптических рецепторов, что позволяет проводить скрининг соединений на основе механизмов их действия.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от этапа раннего поиска до идентификации ведущих соединений (Lead Identification), обеспечивая электрофизиологические показатели, которые позволяют судить о взаимодействии с мишенью и механизме действия в развивающихся нейронных системах.
- Биологические открытия: Объясните, как данный метод способствует проверке гипотез, уточнению путей передачи сигнала или снижению биологических рисков за счет регистрации синаптических свойств и свойств возбудимости клеток Маутнера в интактном препарате заднего мозга и спинного мозга.
- Скрининг: Опишите готовность анализа, его воспроизводимость или количественные результаты, подтвержденные в статье, путем измерения спонтанных и вызванных возбуждающих и тормозных постсинаптических токов в условиях фармакологической изоляции.
- Аналитика: Выделите измерения, показатели или статистические данные, которые помогают исследовательским группам сравнивать условия путем анализа мембранных потенциалов, емкости, сопротивления доступа, а также амплитуды и кинетики синаптических токов.
- Трансляционные исследования: Свяжите метод с преклинической преемственностью или согласованием биомаркеров только в том случае, если это подтверждается источником, путем обеспечения изучения развития синапсов на модели позвоночных, имеющей значение для нейроразвития человека.
- Корпоративное повторное использование: Представьте метод как многократно используемую возможность, а не как разовую технику, подчеркнув возможность возврата к подготовке того же типа клеток (клеток Маутнера) после подготовки для проведения последовательного лонгитюдного анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, снижение неопределенности механизмов функционирования синаптических рецепторов в процессе развития.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость за счет четко определенных этапов диссекции, регистрации и анализа, обеспечивающих сохранение целостности синаптических связей.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышение эффективности использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет возможности ранней оценки воздействия соединений на возбудимость развивающихся нейронов и синаптическую передачу.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных данных о синаптических токах, что снижает риски при работе с мишенями, участвующими в путях нейроразвития.
Особенности реализации
- Необходимый научный опыт в области нейродиссекции, электрофизиологии методом локальной фиксации потенциала (patch clamp) и фармакологической изоляции синаптических токов.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая микроскоп для метода patch clamp, усилитель, систему перфузии и оптику дифференциального интерференционного контраста.
- Требования к межгрупповой стандартизации стадирования эмбрионов, техники диссекции и критериев формирования гигаомного контакта для обеспечения сопоставимости данных в различных экспериментах.
- Особенности адаптации метода для разных модельных систем в связи с различиями в размере нейронов, их доступности и синаптическом составе между эмбрионами zebrafish и препаратами других позвоночных.
- Практические ограничения, обусловленные исходным материалом, включая технические сложности при диссекции и формировании гигаомного контакта, особенно для исследователей, впервые применяющих данный метод.
