Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать синаптические свойства и свойства возбудимости эмбриональных рыб данио-рерио в своих клетках. Это достигается путем предварительного препарирования эмбриона рыбы данио, чтобы обнажить вентральную поверхность заднего мозга. Второй шаг заключается в том, чтобы поместить препарированный препарат на предметное столико для патч-хомута микроскопа и идентифицировать ротовую полость в их клетках.

Следующий патч. Закрепите М-клетки в соответствующем режиме записи и запишите синаптическую активность и свойства возбудимости. Последним шагом является анализ записанных данных для выяснения синаптических или возбудимых свойств.

В конечном счете, зажатие пластыря из этих клеток используется для демонстрации свойств синаптических рецепторов в развивающемся организме. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, сталкиваются с двумя основными трудностями. Первый – это вскрытие.

Второе формирование концертной сцены может быть сложным. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я решил работать над препаратом для рыбок данио, в котором задний мозг был прикреплен к спинному мозгу, демонстрируя процедуру с помощью Буррама Роя, аспиранта моей лаборатории. Сначала закрепите шайбы на горке с помощью смазки.

Затем добавьте жидкую сарду в центр шайбы. Сарда обычно затвердевает за ночь и образует небольшую круглую подстилку на предметном стекле, которая становится основанием анатомической чашки. После того, как на предметное стекло будет наложен защитный листок, поместите предметное стекло в записывающую камеру, которая будет служить основанием для вскрытия.

После этого приготовьте необходимые растворы. Внеклеточные растворы следует оставлять при комнатной температуре, в то время как внутриклеточные растворы должны храниться стерильно. Можно также добавить 0,1% сыпучего для желтого цвета во внутриклеточный раствор, чтобы в конце эксперимента можно было провести визуализацию морфологии М-клеток для подтверждения идентичности клеток.

Затем вырастите эмбрионы рыбы данио дикого типа в яичной воде при температуре 28,5 градусов Цельсия, соберите и разместите в соответствии с предыдущей публикацией. Для вскрытия эмбрионы переносят в чашку для препарирования, которая также служит камерой для регистрации. Затем обезболивайте их в течение семи-10 минут.

В обезболивающем солевом растворе, который очень близок к физиологическому раствору, можно определить, адекватно ли он обезболился, изучив реакцию на легкое пощипывание хвоста. После этого прикрепите эмбрионы к чашке SIL с помощью вольфрамовой проволоки диаметром 0,001 дюйма под препарирующим микроскопом с 25-кратным увеличением. Отрегулируйте увеличение на препарирующем эндоскопе до 40-50 раз, чтобы выполнить рассечение.

Теперь удалите челюсть, глаза и передний мозг с помощью тонких щипцов. Аккуратно отделите задний мозг от подлежащего узлового канатика, осторожно прорабатывая щипцами между узловым канатиком и мозгом. Затем аккуратно переверните задний мозг так, чтобы брюшная поверхность была обращена вверх.

Такое расположение обеспечивает хороший доступ к М-клеткам, которые обычно находятся в пределах от 5 до 10 микрометров от вентральной поверхности у молодых эмбрионов и от 20 до 50 микрометров у более старых личинок. Затем осторожно переместите препарат в установку записи, где можно провести эксперимент с патч-клэмпом. М-ячейки визуализируются с помощью дифференциального интерференционного контраста, хотя для подготовки к зажиму патчей могут использоваться и другие режимы визуализации.

Начните с вытягивания нескольких патч-пипеток CLA с тонкостенным босиликатным стеклом. В горизонтальном дозаторе диаметр наконечника составляет от 0,2 до 0,4 микрометра после огневой полировки до гладкого края, а длина конуса хвостовика составляет около четырех миллиметров. Заполните наконечник пипетки внутриклеточным раствором, погрузив наконечник во внутриклеточную жидкость.

Затем вставьте иглу шприца в пипетку и аккуратно вытолкните из шприца внутриклеточный раствор. Чтобы завершить наполнение пипетки, прикрепите пипетку к головному столику усилителя В электрофизиологической установке важно, чтобы головной столик находился под углом примерно 45 градусов к горизонтальной оси, так как это обеспечивает угол входа пипетки, подходящий для образования высокопрочных уплотнений с ртом в их ячейке непосредственно перед тем, как пипетка опустится в раствор для ванны. Надавите на пипетку с небольшим положительным давлением, чтобы снизить вероятность блокировки наконечника. Продолжайте приближаться к М-клетке с небольшим положительным давлением в пипетке.

Положительное давление мягко толкает клетку из стороны в сторону, и при непосредственном расположении над клеткой образует небольшую ямочку на клеточной мембране. Теперь оставьте пипетку на месте на несколько секунд, чтобы аккуратно очистить поверхность клетки, чтобы между пипеткой и мембраной образовалось прочное уплотнение. Затем сбросьте положительное давление в пипетке, чтобы начать запечатывание.

Небольшое отрицательное давление в сочетании с отрицательным потенциалом пипетки приводит к образованию гига-уплотнений в течение нескольких секунд. Впоследствии измените удерживающий потенциал в усилителе на минус 60 милливольт. Разорвите клеточную мембрану серией коротких импульсов всасывания.

Затем немедленно регистрируются мембранные потенциалы и минимизируются артефакты емкости. Компенсация емкости ячейки и сопротивления доступа на 70–85% Сопротивление доступа следует контролировать каждые 30 секунд или минуту, и при изменении на 20% или более прервать эксперимент. Как только эксперимент закончится и будет получено достаточно данных, пожертвуйте эмбрионом, удалив задний мозг с помощью пары щипцов.

На этом рисунке представлены репрезентативные записи возбуждающих токов A MPA и NMDA, полученных от 48 эмбрионов HPF. Вот спонтанные A MPA ME PSC, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом минус 60 мВ. А это средние МП ЧОП.

Вот спонтанные A MPA и NMDA me PSC, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом 40 милливольт. И это средний показатель МЭ ПСК глутамата МЕ, ПСК были зарегистрированы в присутствии одного микромолярного ТТХ для блокирования потенциалов действия, пяти микромолярных строгих девяти и 100 микромолярного ритоксина для блокирования глицина и появления G. Вот спонтанные ЧПК ИМ, записанные из М-ячейки с удерживающим потенциалом минус 60 милливольт.

А средние ОС ПСК ИМ Им регистрировались при наличии одного микромолярного ТТХ для блокирования потенциалов действия. Одна миллимолярная химерная кислота блокирует активность глутаматных рецепторов и 10 микромоляров Цин блокирует возникновение ГАМК. Это потенциалы действия, регистрируемые М-клеткой в этой конкретной клетке.

Пороговый стимул SRA в 0,48 наноампера вызывает несколько потенциалов действия, но стимул к пороговому значению приводит только к образованию одного потенциала действия. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-четыре часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как залатать зажимную запись из М-клеток и других ретикулярных спинномозговых нейронов у эмбрионов рыбок данио.