Транс-естественных условиях отложенного типа анализа гиперчувствительности к антигену Специальное регулирование

Мы описываем ценный диагностический анализ, которые потенциально могут быть использованы для вывода решить иммуносупрессии после трансплантации без повышенного риска отторжения трансплантата. Анализ использует принципы гиперчувствительность замедленного типа и обеспечивает точную оценку как доноров, так и конкретные нормативные эффекторных иммунных реакций установлен получателями.

Общая цель этой процедуры заключается в использовании анализа trans vivo DTH для мониторинга как про, так и антивоспалительных антиген-специфических реакций у людей. Во-первых, выделите мононуклеарные клетки периферической крови из периферической крови человека. Затем смешайте препарат PBMC с PBS.

Отзыв антигена тестовый антиген и тест антиген плюс отзыв антигена. Приступайте к предварительным измерениям подножки и вводите подготовленные смеси в мыши-полозья. Подушечки лап повторяют измерения через 24 часа. Три.

Окончательные паттерны реакций DTH: возможный регуляторный, нерегуляторный и сенсибилизированный. Анализ гиперчувствительности замедленного типа trans vivo может быть применен для определения клинических параметров, таких как реакции алло, где источником антигена являются клетки донора трансплантата. Основное преимущество этой методики перед существующими методами in vitro заключается в том, что с помощью одной системы анализа можно легко обнаружить как провоспалительные, так и регуляторные реакции на аллоантигены, аутоантигены или опухолевые антигены.

Эгон, исследователь в моей лаборатории, теперь продемонстрирует процедуру использования свежей периферической крови человека, собранной в пробирках с кислотным цитратом декстрозы, чтобы избежать активации тромбоцитов. Выделяют PBMC с помощью среды для разделения лимфоцитов в соответствии со стандартными методами. Промойте препарат PBMC PBS, чтобы удалить загрязняющие тромбоциты.

Если имеется заметное загрязнение эритроцитов, проведите лизис эритроцитов с использованием буфера для лизиса CK. Затем выполните еще две промывки с помощью PBS Resus. Суспендировать PBMC в PBS в концентрации 10 миллионов PBMC на миллилитр для аллоантигена.

Начните с P BMC, выделенных из донорской периферической крови с помощью процедуры, показанной ранее. Затем ресус. Суспензируйте донорские клетки в PBS в концентрации 120 миллионов клеток на миллилитр и добавьте один микромоляр PMSF для предотвращения деградации белка.

Теперь произведите ультразвуковую обработку клеточной суспензии с помощью семи односекундных импульсов с помощью двухмиллиметрового зонда sonica. С помощью гемоцитометра. Проверьте нарушение более 90% клеток.

Затем центрифугируйте смесь при 14 000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Осторожно перенесите надосадочную жидкость в пробирку с двумя безопасными замками и определяйте концентрацию белка стандартными методами для каждой инъекции. Аликвота семь умножить на 10 до шестой P BMC на два миллилитра.

Безопасные замковые трубки гранулируют клетки путем центрифугирования. Сначала приготовьте суспензию отрицательного контроля ПБМК в 35 микролитрах ПБС. Затем для положительного контроля добавьте 25 микролитров антигена отзыва, столбняка, анатоксина, дифтерии, анатоксина и отрегулируйте объем инъекции до 35 микролитров с помощью PBS.

В соответствии с планом эксперимента для оценки специфического донорского ответа, ресуспендировать клеточную гранулу в 10 микролитрах донорского антигена плюс 25 микролитров PBS в общем объеме 35 микролитров. Для оценки экспериментальной регуляции донорского антигена респендируют клеточную таблетку в 35 мкл, добавляя 10 мкл донорского антигена и 25 мкл отзывного антигена TT DT. После обезболивания мышь с изофтором помещает подпружиненный суппорт в центр подушечки лапы так, чтобы один край касался последней подушечки стопы для ходьбы, чтобы обеспечить ориентир для сохранения постоянного места измерения, когда показания манометра стабилизируются.

Запишите базовую толщину подушечки лапы для инъекции подушечки ноги. Поместите шприц иглой к пальцам ног и скосом вверх. Теперь начинаются подкожные инъекции каждой клеточной суспензии в задние подушечки лап мыши.

Во-первых, медленно вводите правую подушечку стопы с подготовкой к отрицательному контролю. Далее введите левую подушечку стопы с положительным контролем PBMC плюс TT dt. Теперь верните мышь в клетку для мыши.

Во-вторых, введите в правую подушечку стопы PBMC плюс алло-антиген, а левую подушечку ноги PBMC плюс алло-антиген плюс TT dt. Убедитесь в отсутствии подтекания примерно через 18-24 часа после инъекции. Обезболите каждую мышь изофтором и повторите измерение отека подушечек лапы.

Вычтите толщину каждой подушечки стопы перед инъекцией из значения после инъекции, чтобы получить значение отека подушечки стопы. Затем рассчитайте антигенспецифичный чистый отек путем вычитания значения отека контрольной подушечки стопы из значений отека подушечек стопы, полученных в результате лечения. Проверьте положительный контроль, показывающий положительный ответ контроля на отзыв антигена TT DT больше или равный 25 умножить на 10 с точностью до минус четвертого дюйма.

Для того, чтобы тест был признан действительным, требуется фоновая реакция на PBS. Далее определяют ингибирование реакций на вспоминание в присутствии донорских антигенов. В этом эксперименте реципиенты почочного трансплантата оцениваются на предмет специфического ответа на донорский антиген и регуляции.

Существует три основных типа гиперчувствительности отсроченного типа у реципиентов трансплантата: регуляторная, нерегулирующая и сенсибилизированная. Все пациенты сильно отреагировали на положительный контроль антигена отзыва tt. У пациента No 62 наблюдается регуляторная картина, характеризующаяся слабым ответом на донорский антиген и выраженным связанным подавлением ответа на отзывный антиген в присутствии донорского антигена.

Было обнаружено, что эта закономерность связана с толерантностью к аллотрансплантату органов. У пациента No 48 наблюдается нерегуляторный паттерн, который характеризуется слабым ответом на донора, но отсутствием связанного подавления. Такая картина часто наблюдается у пациентов, принимающих иммуносупрессивные препараты.

У пациента номер восемь наблюдается донорская сенсибилизация, характеризующаяся высоким ответом на донорский антиген и отсутствием связанного подавления. Такая реакция связана с отторжением трансплантата. В клинических исследованиях P BMC у субъектов, включенных в обсервационное исследование, были проанализированы на специфичный для донора непрямой путь, Т-эффектор и Т-регуляторные реакции для оценки роли донор-специфической регуляции в клинической толерантности.

Косвенные ответы тектора на донорские антигены выявляют отчетливый спектр в группах включения. Отек подушечек стопы увеличивается по мере того, как клинический статус пациента переходит от толерантного к хронически отторженному. В данном случае анализ сцепленного подавления измеряет антидонорский непрямой путь регуляторного ответа на Т.

Эти данные показывают снижение регуляторных реакций в диапазоне от наиболее толерантных пациентов до промежуточных и наименее толерантных пациентов с хроническим отторжением. Взятые вместе. Иммунная регуляция, измеряемая с помощью анализа DTH trans vivo, по-видимому, является важным механизмом принятия почечного аллотрансплантата.

Перспективным направлением является применение анализа TDTH в мониторинге аутоиммунитета. Проведенное нами исследование роли коллагена пятого типа в патологическом процессе синдрома бронхиолита OBL показало, что наиболее высокий относительный риск развития БОС наблюдался у пациентов с положительным ответом на коллаген. Пять pbmc от реципиентов трансплантата легких, но не от здоровых контрольных групп или коллагена.

Четыре реактивных синдрома хорошего пастбища Пациенты после трансплантации почки часто имели коллаген пять реактивных. Анализ TDTH также может быть использован для проверки реактивности pbmc у онкологических пациентов к опухолеспецифическим антигенам. Например, наличие PAP-специфических Т-регуляторных клеток у пациентов с раком предстательной железы может ограничивать ответ на вакцинацию антигеном PAP.

Анализ TRANSVAAL DTH является новым диагностическим тестом с клиническим применением для оценки клеточно-опосредованных иммунных реакций у пациентов с трансплантационным раком и аутоиммунными пациентами. Он ценен, потому что он не только полезен для мониторинга реакций на вспоминание Т-эффектора, но также может быть использован для обнаружения регуляторных реакций Т, поскольку он не полагается на конкретное измерение цитокинов для обнаружения эффекта или регуляторных Т-клеток. Он очень гибкий и широко применимый.