Транс-естественных условиях отложенного типа анализа гиперчувствительности к антигену Специальное регулирование

Общая цель данной процедуры — использование транс-виво анализа реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) для мониторинга как про-, так и противовоспалительных антигенспецифических ответов у людей. Сначала выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из периферической крови испытуемого. Затем смешайте препарат PBMC с PBS.

Реколл-антиген, тестовый антиген и смесь тестового антигена с реколл-антигеном. Выполните предварительные измерения на подушечках лап и введите подготовленные смеси мышам линии SKID. Повторите измерения на подушечках лап через 24 часа. Три.

Определенные паттерны ответов при ЗГС могут быть регуляторными, нерегуляторными и сенсибилизированными. Тест на реакцию гиперчувствительности замедленного типа trans vivo может применяться для определения таких клинических параметров, как аллореакции, когда источником антигена являются клетки донора трансплантата. Основным преимуществом данного метода перед существующими методами in vitro является возможность легкого выявления как провоспалительных, так и регуляторных ответов на аллоантигены, аутоантигены или опухолевые антигены с использованием одной системы анализа.

Эгон, исследователь из моей лаборатории, продемонстрирует процедуру. Используйте свежую периферическую кровь человека, собранную в пробирки с цитратом-декстрозой и кислотой, чтобы избежать активации тромбоцитов. Выделите PBMC, используя среду для сепарации лимфоцитов согласно стандартным методам. Промойте полученную суспензию PBMC с помощью PBS для удаления contaminating platelets.

При заметном загрязнении эритроцитами проведите лизис красных кровяных телец с помощью буфера для лизиса CK. Затем выполните еще две промывки раствором PBS Resus. Ресуспендируйте PBMC в PBS до концентрации 10 миллионов PBMC на миллилитр для определения аллоантигена.

Начните с ПБМК пациента, выделенных из периферической крови донора с помощью процедуры, описанной ранее. Затем проведите ресуспендирование. Суспендируйте донорские клетки в PBS до концентрации 120 миллионов клеток на миллилитр и добавьте 1 мкМ PMSF для предотвращения деградации белков.

Теперь обработайте суспензию клеток ультразвуком, используя семикратный односекундный импульс соникатора с зондом диаметром 2 мм. С помощью гемоцитометра подтвердите разрушение более 90% клеток.

Затем центрифугируйте смесь при 14, 000 RPM при температуре четырех градусов Цельсия в течение 20 минут. Осторожно перенесите супернатант в пробирку Safe-Lock и определите концентрацию белка стандартными методами для каждой инъекции. Разлейте по аликвотам 10⁶ P BMCs в два миллилитра семь раз.

С помощью центрифугирования в пробирках с безопасным замком осаждают клетки. Сначала готовят суспензию PBMC для отрицательного контроля в 35 µL PBS. Затем для положительного контроля добавляют 25 µL антигена памяти (столбнячного и дифтерийного анатоксинов) и доводят объем инъекции до 35 µL с помощью PBS.

Согласно дизайну эксперимента по оценке донор-специфического ответа, ресуспендируйте клеточный осадок в 10 µL донорского антигена и 25 µL PBS до достижения общего объема 35 µL. Для оценки экспериментальной донор-антигенспецифической регуляции ресуспендируйте клеточный осадок до объема 35 µL, добавив 10 µL донорского антигена и 25 µL рекаллирующего антигена TT DT. После анестезии мыши с помощью изофлурана поместите подпружиненный штангенциркуль в центр подушечки лапы так, чтобы один край касался последней опорной подушечки стопы; это послужит ориентиром для обеспечения постоянства места измерения после стабилизации показаний датчика.

Зафиксируйте исходную толщину подушечек лап перед введением инъекции. Расположите шприц так, чтобы игла была направлена к пальцам, а срез иглы был обращен вверх. После этого приступайте к подкожному введению каждой клеточной суспензии в подушечки задних лап мыши.

Во-первых, медленно введите в подушечку правой лапы препарат отрицательного контроля. Затем введите в подушечку левой лапы положительный контроль, состоящий из PBMC и TT dt. После этого верните мышь в клетку.

Во-вторых, в правую подушечку лапы введите PBMC с аллоантигеном, а в левую — PBMC с аллоантигеном и TT dt. Убедитесь в отсутствии утечки через 18–24 часа после инъекции. Проведите анестезию каждой мыши изофлураном и повторно измерьте отек подушечек лап.

Вычтите толщину каждой подушечки лапы до инъекции из значения после инъекции, чтобы получить величину отека подушечки лапы. Затем рассчитайте чистый антигенспецифический отек, вычтя значение отека контрольной подушечки лапы из значений отека, полученных при воздействии исследуемых препаратов. Подтвердите показания положительного контроля: ответ положительного контроля на антиген памяти TT DT должен быть больше или равен 25 × 10⁻⁴ дюйма.

Для того чтобы тест считался валидным, необходим фоновый ответ на PBS. Далее определяют степень подавления ответов при повторной стимуляции в присутствии донорских антигенов. Этот эксперимент позволяет оценить специфический ответ на донорские антигены и регуляцию у реципиентов почечного трансплантата.

У реципиентов трансплантатов наблюдаются три основных паттерна гиперчувствительности замедленного типа: регуляторный, нерегуляторный и сенсибилизированный. Все пациенты продемонстрировали выраженный ответ на положительный контроль с антигеном анамнеза tt. У пациента номер 62 наблюдается регуляторный паттерн, который характеризуется слабым ответом на донорский антиген и выраженным связанным подавлением ответа на антиген анамнеза в присутствии донорского антигена.

Данный паттерн был обнаружен в связи с толерантностью к аллотрансплантату органов. Пациент под номером 48 демонстрирует нерегуляторный паттерн, который характеризуется слабым ответом на донор, но отсутствием связанного с ним подавления. Этот паттерн часто наблюдался у пациентов, принимающих иммунодепрессанты.

У пациента номер восемь наблюдается паттерн сенсибилизации к донору, характеризующийся высоким ответом на антиген донора и отсутствием связанного с ним подавления. Данный ответ ассоциирован с отторжением трансплантата. В клинических исследованиях случаев ПМК пациентов, включенных в обсервационное исследование, анализировали на наличие донор-специфического ответа по непрямому пути, а также ответов эффекторных Т-клеток и регуляторных Т-клеток для оценки роли донор-специфической регуляции в клинической толерантности.

Непрямые Т-клеточные ответы на донорские антигены выявляют отчетливый спектр различий между группами участников. Отек стопы усиливается по мере того, как клинический статус пациента переходит от толерантного состояния к состоянию хронического отторжения. В данном случае метод анализа связанного подавления используется для измерения антидонорского непрямого пути Т-регуляторного ответа.

Эти данные демонстрируют снижение регуляторных ответов в диапазоне от наиболее толерантных пациентов через промежуточную группу к наименее толерантным пациентам с хроническим отторжением. В совокупности эти результаты указывают на то, что иммунная регуляция, измеренная с помощью анализа DTH trans vivo, является важным механизмом приживаемости аллотрансплантата почки.

Перспективной областью является применение анализа TDTH для мониторинга аутоиммунитета. Наше исследование роли коллагена V типа в патологическом процессе при синдроме облитерирующего бронхиолита (BOS) показало, что самый высокий относительный риск развития BOS наблюдался у пациентов с положительным ответом PBMC из реципиентов трансплантата легкого на коллаген, в отличие от здорового контроля.

Четыре пациента с синдромом «хороших пастбищ», имевшие реактивность после трансплантации почки, часто проявляли реактивность к коллагену пять. Анализ TDTH также может быть использован для проверки реактивности PBMC пациентов с онкологическими заболеваниями к опухоль-специфическим антигенам. Например, наличие Т-регуляторных клеток, специфичных к PAP, у пациентов с раком предстательной железы может ограничивать ответ на вакцинацию антигеном PAP.

Анализ TRANSVAAL DTH представляет собой новый диагностический тест, имеющий клиническое применение для оценки клеточного иммунного ответа у пациентов с трансплантатом, онкологическими и аутоиммунными заболеваниями. Ценность данного метода заключается в том, что он полезен не только для мониторинга ответов эффекторных Т-клеток памяти, но и может быть использован для выявления регуляторных Т-ответов, так как он не опирается на измерение конкретных цитокинов для обнаружения эффекторных или регуляторных Т-клеток. Метод отличается высокой гибкостью и широкой применимостью.