В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы обеспечить обнаружение in vivo антиген-специфического уничтожения клетки-мишени на мышиной модели. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области иммунологии, такие как достаточность и обнаружение антиген-специфического цитолитического уничтожения клеток-мишеней в атакуемой иммунной системе и как это может быть изменено путем манипуляций с Т-клетками для усиления функции in vivo. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она позволяет исследователю напрямую и быстро оценить антиген-специфический цитолитический потенциал, так как анализ не зависит от роста опухоли или инфекции.

Эти процедуры будут представлять Кара Хеймейкер и Яред Хайлемайкл из отделения медицинской онкологии меланомы. После обезболивания мышей, согласно текстовому протоколу, используют 70%-ный изопропиловый спирт для опрыскивания области основания хвоста для инъекций. С помощью иглы 27 калибра, прикрепленной к шприцу, и скошенной стороной вверх, проникнуть на четыре-пять миллиметров в область хвостового основания и ввести 100 микролитров предварительно приготовленного пептидного раствора.

Затем, латерально к месту инъекции вакцины, введите 100 микролитров анти-CD4D-антитела. Осторожно нанесите на места прививки крем имиквимод по 50 мг на мышь. Втирайте крем в поверхность до тех пор, пока крем не перестанет быть видимым и полностью не впитается.

Затем введите 100 микролитров 100 000 МЕ на миллилитр рекомбинантного человеческого белка rhIL-2 внутрибрюшинно, в нижнюю часть брюшной полости. После выделения спленоцитов у мышей и лизиса эритроцитов, согласно текстовому протоколу, проводят пептидную пульсацию путем сперва суспендирования клеток в соотношении от 10 до 6 клеток на миллилитр в полной среде. Разделите клетки на две конические пробирки объемом 15 миллилитров и пометьте их как импульсные или неимпульсные.

Для импульсных OVA от 257 до 264 добавьте один микрограмм на миллилитр пептида в пробирку с маркировкой pulsed. Затем инкубируйте импульсные и неимпульсные клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Добавьте по 10 миллилитров готовой среды в импульсные и неимпульсные пробирки, чтобы промыть целевые клетки.

Затем вращайте оставшиеся клетки при температуре 475 x g и комнатной температуре в течение пяти минут, прежде чем аспирировать надосадочную жидкость. Приготовьте среду с высоким уровнем мечения CSFE, добавив 1 микролитр на миллилитр CSFE к RPMI 1640 с 2% FBS, чтобы конечная концентрация составила пять микромоляров на миллиметр. Затем приготовьте среду с низким уровнем мечения CSFE, добавив один микролитр на миллилитр CSFE к RPMI 1640 с 2% FBS, до конечной концентрации 0,5 микромоляра на миллилитр.

Для мечения целевых спленолитов ресуспендируют от 10 до 6 клеток на миллилитр импульсных клеток с подготовленной средой с высоким мечением КСФЭ и от 10 до 6 клеток на миллилитр неимпульсных клеток с низким уровнем мечения КСФ. Смешайте клеточные суспензии путем легкой инверсии или закручивания. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, перемешивая клетки каждые пять минут.

Затем добавьте 10 миллилитров полной среды в каждую клеточную суспензию и центрифугируйте клетки при 475 х г и комнатной температуре в течение пяти минут. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и используйте 10 миллилитров холодного PBS для ресуспендирования клеток. Вращайте ячейки при температуре 475 x g и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут, прежде чем повторить промывку PBS.

Подсчитайте клетки и смешайте пептидно-импульсные CSFE с высоким уровнем мечения с неимпульсными клетками CSFE с низким уровнем мечения в соотношении 1:1 для инъекции мышам-реципиентам. Сохраняйте аликвоту от одного умноженного на 10 до шестой смешанной клетки для использования для оценки исходного уровня проточной цитометрии. После введения и повторной изоляции клеток-мишеней, согласно текстовому протоколу, проводят оценку активности CTL с помощью стандартного протокола проточной цитометрии, приобретая клетки с помощью канала FITC с лазером 488 нм для возбуждения.

Перед введением меченых CSFE клеток-мишеней смесь клеток 1:1 пропускали на проточном цитометре для определения исходных частот как высоких, так и низких целевых клеток CSFE. Здесь показана стратегия стробирования для обнаружения изменений в популяциях CSFE. Первоначальный затвор был изготовлен с использованием параметров FSC и SSC.

Затем общее количество положительных клеток CSFE было субгатировано перед оценкой изменений частоты, поскольку эта популяция относительно мала по сравнению с немечеными эндогенными спенлоцитами. Здесь показан пример относительной частоты популяций CSFE до инъекции и должна быть близка к одному к одному. Необходимость прайминга covex видна на этой панели, где в течение 24 часов после инъекции не наблюдалось уничтожения высокоцелевых клеток антиген-импульса CSFE.

Этот рисунок демонстрирует эффективное уничтожение антиген-импульсных клеток-мишеней CSFE с высоким уровнем мечения, поскольку пик, который наблюдался до инъекции, был почти незамеченным, и это соотношение резко сместилось с 50% до 1% обнаружения. Наконец, на рисунке также показана кинетика уничтожения клеток-мишеней с высоким уровнем метки CSFE с помощью антиген-импульсов путем оценки потери этой популяции как через 6, так и через 24 часа после инъекции. После освоения эта техника может быть выполнена за два-три дня, в зависимости от антигена и функции Т-клеток.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что мечение CSFE должно быть единообразным, а кинетика реакции CTL должна быть оценена до проведения анализа. После этой процедуры также могут быть выполнены другие методы, такие как ИФА, ELISPOT и окрашивание внутриклеточной проточной цитометрией, чтобы оценить изменения в эффекторной функции и ответить на другие дополнительные вопросы. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как оценить функцию CTL in vivo при отсутствии инфекции или опухоли.