Градиента плотности многослойных полимеризации (DGMP): новый метод для создания Multi-купе, Настраиваемые Строительные леса для тканевой инженерии

Общая цель этой процедуры заключается в создании многослойного каркаса клеточных культур. В этом видео будет показано, как получить 2D-матрицу клеточной культуры, включающую пептид адгезии RGDS в чередующихся слоях для разделения областей клеток C и C 12. Это достигается путем предварительного связывания пептида RGDS с макро-лояльным макросом.

Затем комбинацию макропептидов помечают красителем LOR, чтобы обеспечить визуализацию пептида, содержащего слои многослойных гелей. Второй шаг заключается в формировании форм, вырезав их из силиконового листа и поместив между двумя стеклянными предметными стеклами, следующими за премом, смешивая отдельные компоненты каждого слоя. Решения peg di acrl и peg di acrl с PEG RGDS Alexa three 50 поочередно наслаиваются внутри форм.

Гели полимеризуются под действием ультрафиолетового излучения. Заключительным этапом является посев двух клеток C 12 в двухмерные многослойные гели, чтобы изучить, как состав матрицы влияет на рост и прикрепление клеток. В конечном счете, светлопольная и флуоресцентная микроскопия используются для визуализации избирательного роста клеток C two C 12 на скаффолдах.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что это простой и экономичный метод создания многослойных 2D и 3D матриц клеточных культур. Он не зависит от необходимости использования дорогостоящих контрольно-измерительных приборов. В то время как границы между слоями являются смежными и структурно целостными.

Не происходит смешивания между компонентами отдельных слоев. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, например, как клетки мигрируют и поляризуются в ответ на структурированные биологические, химические и механические сигналы. Этот метод может обеспечить мягкое понимание миграции и дифференцировки клеток и может быть применен к другим системам, таким как направление нового правильного роста и синаптогенеза нейрональных стволовых клеток.

Чтобы начать эту процедуру, смешайте пептид RGDS и метиловый эфир сукцинилкарбометилового эфира масла акромасла в соотношении один к двум к одному в сухом ДМСО под Аргоннской конвенцией. Затем добавьте NN diop, пропилметиламин или D-I-P-E-A в молярном соотношении два к одному относительно aquilo PEG SCM, чтобы облегчить реакцию, подтвердите конъюгацию молекулы aquilo PEG RGDS с помощью масс-спектрометрии с заплесневелым TOF. Для этого отдельно добавьте один микролитр реакционного раствора AQUILO PEG RGDS, и один микролитр нереактивного aquilo PEG SCM в разные места на заплесневелой мишени.

Дайте им обоим высохнуть. Затем приготовьте насыщенный раствор универсальной заплесневелой матрицы в вихре ТГФ в течение одной минуты и добавьте по одному микролитру в те же два пятна. Дайте им обоим высохнуть.

Далее загрузите сэмплы. Выполняйте сложный анализ с помощью лазера с частотой 60 Гц и мощностью около 19% с использованием алгоритмов SAVIS Gole, сглаживания, вычитания базовой линии цилиндра и обнаружения пиков OID. Молекулярная масса акро ПЭГ RGDS должна быть смещена вправо, что соответствует изменению массы за счет ковалентно связанного пептида.

Следующим шагом является конъюгирование фтора путем добавления эквимолярного количества LOR трех 50 карбоновых кислот, всасывание среднего эфира относительно aquilo PEG SCM, растворенного в минимальном объеме ДМСО, в реакционный раствор aquilo PEG RGDS под аргоном инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. Затем очистите акромасляный стержень RGD S3 50 путем диализа против красящей воды при четырех градусах Цельсия с помощью диализной кассеты с молекулярной массой 3 500 DAU. Продолжайте диализ в течение 48 часов, используя объемное соотношение 1001, меняя холодный диализат не менее двух раз в день.

Продукт дополнительно очищается путем стерилизации фильтра через шприцевой фильтр толщиной 0,22 микрона. Наконец, в стерильной среде стерильное очищенное акро-масло петь RGD S3 50 в стерильные предварительно взвешенные микроцентрифужные пробирки. Запечатайте открытые микроцентрифужные пробирки в стерильную дыхательную трубку.

Сублимационно высушите образцы и храните каждый запечатанный парафиновой пленкой при температуре минус 20 градусов Цельсия. Предварительно вымойте горки в 100% метаноле и высушите в духовке при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока жидкость не испарится. Затем поместите чашку со стеклянными предметными стеклами в вытяжной шкаф и добавьте 250 микролитров сигма-слоя на каждый предметный знак.

Аккуратно покачивайте слайды в течение 30 секунд, чтобы покрыть всю поверхность. Далее тщательно промойте покрытые стекла 100% метанолом с последующей промывкой и дистиллированной водой, замочив их дважды на пять минут не менее чем в 10 миллилитрах воды. После промывки дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе.

Подготовьте силиконовые пространства толщиной 0,8 миллиметра, обрезав лист силикона до тех же размеров, что и предметные стекла. Затем с помощью проколов для биопсии сделайте 10-миллиметровые или восьмимиллиметровые отверстия в силиконе для удержания скаффолдов с помощью бритвенного лезвия. Сделайте около двух миллиметровых каналов в верхней части формы, чтобы можно было добавить материал для строительных лесов.

Затем автоклавируйте силиконовые пространства и обработайте стеклостекла сигма-покрытием для их стерилизации. Также простерилизуйте дополнительные материалы для литья гелей, такие как эйноровые трубки и щипцы. В тканевом культуральном фильтре капюшона стерилизуют стоковый раствор Peg di aquil с помощью стерильного одномиллилитрового шприца и фильтра 0,2 мкм.

Начните с составления рецептурных растворов ПЭГ с соотношением массы к объему 15% для каждого соответствующего слоя в отдельных пробирках с микроотходами янтарного цвета, комбинируя 50% PEG D acrl с различными количествами стерильного исходного раствора 60% IO DAL PBS и фотоинициатора для получения различных конечных концентраций 10%, 20%, 30% и 40% I, тщательно перемешайте растворы для приготовления флуоресцентно меченного раствора 15% предварительного полимера ПЭГ. Соедините 50% PEG di aquil и aquilo PEG RGD S3 50 в конечной концентрации восемь миллимоляров со стоковым раствором IO Dal PBS и фотоинициатором в янтарных пробирках Microview для получения концентраций 15%, 25% и 35% IO IAL тщательно перемешайте растворы. Затем соберите форму, поместив предварительно вырезанную распорку между двумя стеклянными предметными стеклами, обработанными sigma co, и закрепите зажимами. После того, как форма собрана, отлите слой геля, добавив сначала 10 микролитров 40%-ного раствора, а затем 10 микролитров флуоресцентно меченного 35%-ного раствора.

Повторите чередование слоев, чтобы получить несколько слоев. Затем облучайте форму светом с яркостью 365 нанометров в течение трех минут. Используя портативную лампу UVR 9, 000, дайте полимеризованным гидрогелям застыть в течение пяти минут.

Затем снимите зажимы и аккуратно поднимите верхнюю стеклянную горку и форму. Стратифицированный градиент плотности. Мультиуложенные гели полимеризации или DG MP останутся на предметных стеклах.

С помощью стерильного шпателя осторожно извлеките гели из формы и поместите их в 50-миллилитровую пробирку, содержащую стерильный DMEM. Простирайте полимеризованные гели в соотношении 1000 к одному DMEM в течение 48 часов с двумя обменами буфера в день. При этом будет удалена любая плотность, модификатор, фотоинициатор и на реакцию преполимера.

Затем храните гели DGMP в DMEM с добавлением 1% пенициллина стрептомицина. Чтобы визуализировать чередующиеся слои, расположите гель DGMP вдоль линейки на лотке для образцов блока документации по гелю. Затем экспонируйте и визуализируйте гели с помощью трех 50 чередующихся темных и синих полос в гидрогеле DGMP, демонстрируя образование дискретных слоев с различным химическим составом.

Чтобы приготовить гели DGMP для клеточной культуры, аккуратно введите их в лунки 48-луночного планшета для клеточной культуры. С помощью стерильного скребка для клеток промыть их три раза в клеточной культуральной среде. Затем соберите два миобласта C 12 из 100-миллиметрового клеточного планшета, когда они на 60% слиты.

Для этого трижды ополосните тарелку с помощью подогретого ПБС. Затем добавьте один миллилитр 0,25% трипса в ЭДТА и выдержите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. После того, как клетки отделятся, добавьте один миллилитр предварительно теплой питательной среды и переложите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования.

После того, как клетки были гранулированы по методу Риза, загоните их в питательную среду и подсчитайте живые клетки, добавив триам синий и используя счетчик клеток TC 10. Затем засейте каркас DG MP двумя C 12 миобластами и инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Подтвердите прикрепление С, двух С-12 миобластов на РГДС, содержащих слои гелей DGMP, с помощью эпифлуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии.

Чередующиеся слои гелей DGMP могут содержать различные пептиды, такие как RGDS, показанный справа, который поддерживает клеточное прикрепление и рост. Слой слева, однако, не содержал пептидов клеточного прикрепления, и клетки не выжили в этой области. IO диол может влиять на жесткость геля.

Здесь модуль упругости был измерен с помощью атомно-силовой микроскопии. При использовании 30% IAL в этой формуле геля наблюдалось увеличение жесткости на 60%, влияние IAL на жесткость геля может варьироваться в зависимости от используемых материалов При попытке выполнения этой процедуры важно помнить последовательность слоев. Слой, содержащий наибольшее количество IEX null, будет внизу, а слой с наименьшим количеством IEX null будет вверху.

Всегда не забывайте добавлять инициатор фотографии в конце, чтобы предотвратить полимеризацию от окружающего света. Вместе с нашими коллегами мы адаптируем эту технику для организации роста нейритов в 3D. Это позволит сравнивать нейропрогениторные клетки, полученные от здоровых людей и от пациентов с нарушениями развития нервной системы.

Не забывайте, что работа с ультрафиолетовым излучением может быть опасной. Надевайте защитные очки от ультрафиолета во время выполнения этапа сшивания.