Анализ функций генов и визуализации реснички, созданного потока жидкости в Vesicle Купфера

Целью этой процедуры является модуляция функциональных генов в везикуле Kavas или KV в эмбрионе данио-рерио, который отвечает за лево-правое структурирование, и анализ асимметричного потока жидкости, генерируемого motil clia путем доставки флуоресцентных шариков в kv. Это достигается путем введения флуоресцентных морфо-олигонуклеотидов, которые подавляют экспрессию специфического гена, представляющего интерес в желточной клетке эмбриона средней стадии Dilla, так что они загружаются в дорсальные клетки-предшественники, которые дают начало kv. Далее для дальнейшего анализа отбираются вводимые эмбрионы, которые имеют флуоресцентные морфозы только в желточной клетке и kv.

Затем эмбрионы помещают в депрессионные стекла и флуоресцентные шарики вводят в заполненный жидкостью просвет везикулы kv. Наконец, видеомикроскопия используется для записи бусин, протекающих внутри кв. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые определяют, изменяет ли тканеспецифическое истощение гена-кандидата в KV асимметричный поток жидкости с помощью количественного анализа движений шариков.

Вирусная демонстрация в этом семестре имеет решающее значение, поскольку поэтапные инъекции молино и инъекции флуоресцентных шариков трудно освоить, потому что и то, и другое зависит от положения эмбриона и времени развития эксперимента. Чтобы выполнить инъекции global morph или MO, сразу после оплодотворения соберите эмбрионы и загрузите их в инъекционную пластину. Используйте огонь, отполированный мимо нашей пипетки, чтобы поместить эмбрионы в инъекционную пластину, чтобы обездвижить эмбрионы.

Сломайте кончик инъекционной иглы и отрегулируйте настройки инъекции, чтобы создать каплю для инъекции объемом один нанолитр. Используя препарирующий микроскоп, введите один нанолитр МО в ярмо не менее 50 эмбрионов между одной и четырьмя клеточными стадиями. Для таргетированной инъекции DFC M mo собирают эмбрионы сразу после оплодотворения и инкубируют при температуре 28,5 градусов Цельсия.

Когда эмбрионы достигнут 256-й клеточной стадии, быстро загрузите их в инъекционную пластину и введите в желток один нанолитр флуоресцентного МО. Введите не менее 100 эмбрионов между 256 и 1000 клеточными стадиями, чтобы выполнить целевую инъекцию желтка. После инкубации оплодотворенных яиц до купольной стадии введите один нанолитр флуоресцентного МО в ярмо не менее 100 эмбрионов между куполом и 30% слоеных стадий.

При вводе M mo эмбрионы достигают 75% стадии слоя. Удалите неоплодотворенные и мертвые эмбрионы под препарирующим микроскопом для глобальных инъекций МО. Выбирайте живые эмбрионы, чтобы флуоресценция равномерно распределялась по всем клеткам.

Для целевых инъекций M mo DFC отбирайте эмбрионы с флуоресценцией, диффундирующей по всему желтку и сконцентрированной на дорсальном крае дермы. Для желтка целенаправленно делают инъекции МО. Выбирайте эмбрионы, у которых флуоресценция равномерно распределена по всему желтку и не наблюдается ни в каких эмбриональных клетках от двух до четырех.

Так что клещевые стадии. Выберите целевые эмбрионы DFC, которые проявляют флуоресценцию только в клетках KV и желтке, и отбросьте остальные для целевых инъекций желтка. Отбирайте эмбрионы с флуоресценцией исключительно в желтке для анализа асимметричного течения в КВ МО введенных эмбрионов начните с использования острых щипцов, чтобы тщательно покрыть около 20 эмбрионов от четырех до шести.

То же самое можно сказать и о стадиях, переносе одного эмбриона на предметное стекло и удалении как можно большего количества воды. Обездвижите эмбрион, добавив достаточно теплого аэродинамического слоя с низкой температурой плавления 1%, чтобы просто покрыть его, когда аэродинамик затвердеет. С помощью щипцов расположите его так, чтобы КВ был обращен вверх, оберните 10 эмбрионов, работая быстро, чтобы все инъекции были завершены к 10 эмбрионам.

Так что клещ стадия. После разведения флуоресцентных микрошариков диаметром 0,5 мкм до одного к 50 в стерильной воде. Тщательно перемешайте шарики и загрузите три микролитра в капиллярную иглу с помощью того же микроинжектора, который используется для инъекций МО.

С помощью щипцов сломайте кончик иглы и отрегулируйте настройки инъекции, чтобы сделать максимально маленькую инъекцию. Капля. Далее под препарирующим микроскопом выровняйте иглу по просвету KV первого смонтированного эмбриона. Затем введите иглу в просвет и введите менее 0,5 нанолитров шариков.

Добавьте каплю стерильной воды на арос, чтобы избежать высыхания эмбриона под вертикальным флуоресцентным микроскопом. С помощью 20-кратного объективного скрининга введенные эмбрионы для успешной доставки бусин для каждого выбранного эмбриона с бусинами внутри КВ с каплей стерильной воды, чтобы покрыть арос. Затем наблюдайте с помощью флуоресцентного составного микроскопа с объективом для погружения в воду с 63-кратным увеличением.

С помощью высокоскоростной камеры, установленной на микроскопе, можно записать десятисекундный видеоролик. Используйте флуоресцентный канал для записи шариков с частотой около 70 кадров в секунду и используйте светлый или дифференциальный интерференционный контраст для записи люмен KV. Импортируйте фильмы в Image J. Создайте максимальное количество проекций и используйте программное обеспечение для отслеживания движений отдельных бусин.

На этом рисунке показано распределение флуоресцентного МО в живых эмбрионах, введенных в организм на успешной стадии. Здесь показана неудачная инъекция МО, при которой раствор остается агрегированным в желтковой клетке. Поток жидкости в успешно инъецированных эмбрионах может быть измерен качественно или количественно в контрольном эмбрионе с шариками с нормальным потоком.

Следуйте траекториям против часовой стрелки, которые можно визуализировать, сделав максимальную проекцию положения флуоресцентных бусин во времени или отслеживая отдельные бусины во времени. Для демонстрации потери скоординированного потока эмбрионам вводили МО для разрушения ряда киназы два В или камня два В, что нарушает поток, и в результате бусины перемещаются хаотично в kv, средняя скорость пяти бусин из контроля и камня два В mo эмбрионов показана здесь После его развития. Эта техническая технология проложила путь исследователям в области биологии развития к изучению генов и механизмов в установлении доступа к левому правому телу у рыбок данио.