Отслеживание и Количественная процессов развития в

Общая цель использования программного обеспечения для анализа изображений в биологии развития заключается в получении количественных данных для построения механистических моделей биологических процессов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии развития, например, как количественно анализировать фенотипы мутантов? Основным преимуществом данной методологии является то, что она дает исследователям возможность объективно выявлять изменения в биологических процессах и явлениях развития.

Хотя этот метод может быть использован для изучения развития и морфогенеза sea elegance, его также можно применить к другим модельным организмам, таким как josepha. Реконструкцию формы клетки с помощью IOD продемонстрирует CINA Leman, аспирант моей лаборатории. После установки программы IM MOD откройте командную оболочку и введите Im mod в окне IM mod. Выберите файл с соответствующими необработанными данными, на основе которых будет создана 3D-модель, и используйте окно информации, чтобы определить нижнюю и верхнюю границы объектов в окне zap.

В окне информации снова обведите контуры клеток, создавая первый контур на верхней плоскости каждой клетки и следя за тем, чтобы для каждой клетки создавался отдельный объект. Затем прокрутите изображение по оси Z и создайте новый контур для каждой плоскости Z, соответственно создавая новый объект для каждой клетки. После обводки достаточного для модели количества клеток откройте окно просмотра модели, чтобы проверить объекты и их контуры.

Затем на панели инструментов режима просмотра модели выберите «edit» (редактировать) и «objects» (объекты). Откроется соответствующее окно редактирования, позволяющее моделировать все клетки в виде заполненных и замкнутых объектов. В качестве типа данных рисования («draw data type») выберите «mesh» (сетка), а в качестве стиля рисования («drawing style») — «fill» (заполнение).

Нажмите на «meshing» и выберите опцию «cap». Затем отметьте все необходимые объекты и нажмите «mesh». Программа создаст твердотельные объекты из стеков контуров.

Измените масштаб по оси Z в окне просмотра, чтобы при необходимости отрегулировать коэффициент дискретизации по Z. Затем в меню редактирования выберите пункт «вид», чтобы повернуть 3D-объекты, сохраняя снимки или видеоролики клеток по мере необходимости для отслеживания объектов на записях флуоресцентного таймлапса. Сначала с помощью NDR преобразуйте необработанные данные в файл формата TIFF.

Затем откройте файл. В меню End drop выберите значок 2D-визуализатора и нажмите на значок масштабирования диапазона, чтобы настроить гистограмму в меню данных.

Выберите файл, имя, изображение, набор, канал и установите разрешение по осям X, Y, Z, введя соответствующие значения X, Y и Z. Чтобы аннотировать ядра, перейдите в интересующую плоскость и снова выберите 2D-просмотр. Затем выберите «lineage» в выпадающем меню и нажмите «new lineage».

Нажмите и перетащите курсор на интересующее вас ядро, чтобы отметить его. Затем щелкните правой кнопкой мыши по ядру и выберите «rename particle» (переименовать частицу). В выпадающем меню введите название частицы, а затем перетащите значок стрелки, чтобы изменить диаметр круга.

Затем нажмите на правую иконку, чтобы отметить центральную плоскость ядра. После этого, чтобы переместиться вперед по времени и плоскостям, выберите параметры кадра (frame) и Z на нижней панели инструментов и соответствующим образом отрегулируйте положение или размер круга, обозначающего ядро, до момента деления отслеживаемой клетки. При обнаружении деления клетки отметьте дочерние ядра и нажмите на иконку окон, чтобы перейти к построению родословной (lineage).

Пользователь одновременно отмечает все три ядра и выбирает «associate parent» (связать с родительским объектом) в опции lineage (линия наследования). Затем, когда все клетки будут отслежены, нажмите на имя файла и переключитесь на соответствующий канал. Отметка остатка клеточного деления для количественного анализа кортикального потока с использованием программного обеспечения для анализа симметрии скорости частиц (particle image velocity symmetry software).

Загрузите новые файлы изображений в pif lab и выберите стиль секвенирования. 1, 2, 2, 3. Затем перейдите в каталог, содержащий последовательность нужных изображений.

Выберите изображения и нажмите «добавить», чтобы импортировать их. Затем в настройках анализа выберите «исключения» (exclusions). Используйте кнопку «Маска ROI» (ROI mask).

Нарисуйте маски для текущего кадра, чтобы деактивировать ненужные части изображений в настройках анализа. Снова выберите настройки PIF и укажите деформацию окна быстрого преобразования Фурье в качестве желаемого алгоритма PIF. Для первого прохода введите значение области опроса 64 pixels с шагом 32 для второго прохода.

Введите значение области допроса 32 пикселя с шагом 16. Затем выберите «linear» в выпадающем меню деформации окна и выберите метод Гаусса по двум на три точки для оценки субпиксельного смещения. Теперь выберите «analyze» в меню анализа и «analyze all frames post-processing» (анализ всех кадров после обработки), выберите «vector validation» в меню постобработки и примените порог фильтра стандартного отклонения семь ко всем кадрам в меню графиков.

Выберите производные параметры. Измените данные, затем векторы, количество пикселей на кадр, а также настройте плавность векторов и фильтр высоких частот. После применения этих настроек ко всем кадрам установите диапазон используемых кадров от первого до последнего.

Наконец, нажмите кнопку calculate mean vectors, чтобы измерить средние векторы всех кадров, сосредоточив внимание на изгибе гонады взрослых особей C elegance дикого типа, полученных в результате только что продемонстрированной съемки. На основе данных микроскопии создается 3D-модель герминативных клеток, что позволяет с помощью двухцветной тайм-лапс микроскопии анализировать изменения размера клеток, происходящие при их переходе из дистального в проксимальный отдел гонады. Модели, полученные с помощью гистоновых слитых белков и немышечного миозина в NDR, иллюстрируют стереотипный паттерн деления клеток и наследования ремнантов.

Кроме того, на основе данных о линиях в этом эксперименте можно получить траектории для каждой клетки L и остатков деления клеток, а также корреляцию с временем деления клеток. Была проведена краткосрочная тайм-лапс микроскопия с высоким временным разрешением кортикального немышечного миозина II для оценки различий в динамике кортикального поляризующего потока между эмбрионами дикого типа и эмбрионами с дефицитом белка RGA3, активирующего Rho GTPase, как и ожидалось. Поток в эмбрионах дикого типа был преимущественно направлен вдоль длинной оси эмбриона.

В то время как поток в эмбрионе с РНК-интерференцией RGA three был ортогонален этой оси, что легко прослеживается при анализе PIP. После освоения метода ручная сегментация сложных объектов и трекинг клеток в ходе эмбрионального развития могут быть выполнены за несколько часов при правильном подходе к проведению трекинга клеток и объектов. Важно помнить о необходимости установить соответствующее временное разрешение, чтобы не потерять объект в ходе анализа при использовании трех описанных здесь инструментов.

Также может быть проведен статистический анализ для изучения вариабельности или просто для сравнения различных эмбрионов. Использование программного обеспечения для количественного анализа изображений позволяет нам и другим биологам развития исследовать морфогенетические механизмы развития на беспрецедентном уровне детализации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать разнообразный набор программных инструментов для проведения количественного анализа изображений.