Измерение внутриклеточного Са ^{2 +} Изменения в человеческой спермы с помощью четырех методов: Обычные флуорометрии, остановленной струи флуорометрии, проточной цитометрии и односпальная изображений Сотовые

Общая цель этой процедуры заключается в измерении внутриклеточных колебаний кальция в сперме человека с помощью флуоресцентных красителей. Это достигается путем предварительной подготовки образца спермы методом «плавания» и, при необходимости, стимулирования емкости. Вторым шагом является загрузка сперматозоидов кальциевым флуоресцентным красителем.

Затем, используя обычную флуориметрию с остановкой потока, проточную цитометрию или визуализацию отдельных клеток, проведите эксперимент и запишите измерения кальция. В конечном счете, результаты анализируются для определения изменений внутриклеточных концентраций кальция, вызванных прогестероном или в процессе капсулирования. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, например, с использованием радиоактивности, заключается в том, что это очень чувствительная процедура.

Это безопасно и просто в исполнении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов кальция SPR, такие как идентификация соединений, которые индуцируют внутриклеточный кальций, увеличивающийся с высоким пространственным и временным разрешением, и идентификация различных клеточных субпопуляций в образце вируса. Последствия использования, например, метода проточной цитометрии распространяются на диагностику проблем фертильности через анализ физиологического состояния мужских гамм.

Несмотря на то, что этот метод может дать представление об изучении мобилизации кальция в сперме человека, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как мужские гаммы других видов или другие типы клеток, такие как нейроны или мышечные клетки. Как правило, люди, использующие этот метод, испытывают трудности, потому что работа со сперматозоидами непроста, и важно поддерживать соответствующие условия для получения жизнеспособных и моторных клеток в ходе эксперимента. Мы реализовали использование этих техник путем комбинирования стратегий с использованием разных областей.

Визуальная демонстрация этого метода важна, так как подготовка и обращение с образцом, а также добавление соединений трудно изучить, поскольку сперматозоиды могут быть повреждены во время процедуры, а артефакты в ответах могут быть получены во время редактирования соединений. Чтобы подготовить образец спермы, один миллилитр ветчины F 10 должен быть тщательно выложен поверх каждого 500 микролитра разжиженной спермы. Eloqua, коснитесь стенки пробирки кончиком микропипетки и аккуратно распределите среду над образцом.

Очень важно делать это медленно, чтобы избежать смешивания образцов и слоев среды. Среда дополнена двумя миллимолярами хлорида кальция и пятью миллиграммами на миллилитр БСА. Чтобы стимулировать емкость in vitro, осторожно наклоните трубки под углом примерно 30 градусов.

Это увеличит площадь поверхности между двумя жидкостями, тем самым увеличив вытеснение или всплытие сперматозоидов из образца в среду во время инкубации. Затем поместите голодные пробирки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. 95% воздуха в течение одного часа после одного часа.

С помощью микропипетки осторожно удалите из каждой пробирки верхние 700 микролитров ветчины F 10 среды, которая теперь содержит сперматозоиды мотил. Соберите все собранные образцы в одну чистую стеклянную пробирку, избегая образования пузырьков. Поместите 10 микролитров объединенного образца на оптическое плоское стекло основания макулярной счетной камеры и установите покровное стекло.

Следите за тем, чтобы в камере не образовывались пузырьки, так как это может привести к неточному подсчету клеток. Наблюдайте под составным микроскопом, оснащенным объективом с 20-кратным увеличением. На покровном стекле макулярной счетной камеры изображен большой квадрат, состоящий из 100 меньших квадратов.

Посчитайте ячейки в любой полосе из 10 квадратов. Это число представляет собой концентрацию клеток в миллионах клеток на миллилитр. Повторите подсчет на двух дополнительных 10 квадратных полосках и рассчитайте среднее значение трех счетов для загрузки ячеек флуоресцентным красителем.

Соедините в 1,5-миллилитровой фуге-пробирке необходимый объем сперматозоидной суспензии с достаточным количеством одного миллимолярного гриппа в 3:00 AM стокового раствора для получения окончательной концентрации двух микромоляров гриппа. В 3:00 AM инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и защищенной от света центрифугой в 750 G в течение пяти минут. Образование облака, а не гранулы, указывает на то, что клетки находятся в хорошем состоянии, аспирируют и отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в соответствующем объеме человеческой сперматозоидной среды или HSM. Чтобы начать этот эксперимент, соедините в стеклянной трубке с плоским дном 570 микролитров HSM и 30 микролитров суспензии сперматозоидов, предварительно загруженных гриппом в 3:00 AM и ресуспендированных в HSM, чтобы получить один умножить на 10 до восьмых клеток на миллилитр.

Поместите магнитную мешалку внутрь стеклянной трубки и вставьте трубку в считывающую камеру спектрометра, предварительно нагретую до 37 градусов Цельсия. Образец необходимо перемешивать в течение всего времени сбора. Начните эксперимент с помощью программного обеспечения oli и приступайте к получению значений флуоресценции с частотой 0,5 герц в течение 300 секунд.

После получения базальной флуоресценции в течение 30 секунд с помощью шприца Hamilton Micro введите соответствующий объем исследуемого соединения, в данном случае микромолярного прогестерона, через 100 секунд. При 20 микромолярных ионах мицин в качестве положительного контроля для получения максимального значения флуоресценции. В этом эксперименте внутриклеточные изменения кальция измеряются с высоким временным разрешением.

Используя смеситель с остановленным потоком SFM, соединенный с оптической системой бешеной кинетики, наполните один из шприцев инструмента одним миллилитром гриппа. 3:00 AM загрузили сперматозоиды, а второй шприц одним миллилитром исследуемого соединения. 20 микромолярных прогестеронов растворили в HSM.

В этом примере важно избежать образования пузырьков при втягивании жидкостей в шприцы. Поднимите оба поршня прибора до тех пор, пока они не коснутся кончика плунжеров шприца. Установите общее время выборки в этом случае равным 50 секундам и частоте 10 миллисекунд, чтобы свести к минимуму повреждение клетки, установите скорость потока на минимальное значение, которое обеспечит измеримый триггер отклика.

При смешивании реагентов, след сырой флуоресценции по отношению к тимьяну будет отображаться на экране компьютера. Повторите эту процедуру, заменив прогестерон на HSM в качестве отрицательного контроля и мицин с 10 микромолярными ионами в качестве положительного контроля перед проточной цитометрией. Подготовьте экспериментальные образцы, поместив по 500 микролитров клеточной суспензии в каждую цитометрическую пробирку при каждом тестируемом состоянии.

Организуйте эксперимент с помощью программного обеспечения оборудования. Сначала создайте новую папку, образец для эксперимента и количество пробирок. Затем выберите подходящие настройки цитометра для гриппа O 3:00 AM. Используйте фильтры флуоресцеина изотиоцианата и йодида пропидия.

Пропустите неокрашенные контрольные пробирки одну и вторую в цитометр. Соберите данные о прямом и боковом рассеянии, чтобы убедиться в правильности настроек пороговых значений и создать соответствующий вентиль для различения мусора от ячеек. Запустите экспериментальные пробирки и соберите данные флуоресценции из 10 000 событий на образец.

В конце. Экспортируйте все данные в программное обеспечение, доступное для анализа. Подготовьте круглые покровные листы, необходимые для этой процедуры, нанеся на центр каждого покровного стекла каплю в пять микролитров раствора поли-L лизина.

Оставьте не менее чем на час перед использованием, промойте обработанный участок водой. Это удалит избыток полилизина и позволит сперматозоидам прилипнуть к покрову, сползти с головки, в то время как их жгутики все еще могут двигаться. Соберите крышку внутри камеры записи.

Поместите 10 микролитров гриппа в 3:00 утра в нагруженные клетки в концентрации от одного умножить на 10 до седьмой клетки на миллилитр. В центре крышки накладывайте слип. Налейте на ячейки 200 микролитров предварительно прогретого HSM.

Поместите камеру на предметное столико микроскопа, предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия, и просмотрите ячейки с помощью фазового контраста. Выберите область, в которой плотность клеток подходит для визуализации. Слишком большое количество ячеек затрудняет анализ из-за перекрытия сигналов.

Клетки должны быть прочно прикреплены к покровной планке за их голову, но проявлять движение жгутиков, что подтверждает жизнеспособность. Начните эксперимент, активировав программное обеспечение для получения изображений временных рядов. Как правило, требуется четыре изображения в секунду с освещенностью в две миллисекунды на изображение.

Получение флуоресцентных изображений в режиме реального времени. Для регулировки фокуса и яркости. С помощью микропипетки осторожно добавьте по каплям исследуемое соединение прогестерон в этом случае и продолжайте получение изображения по мере необходимости.

Выполните два последовательных контрольных присоединения в одну и ту же камеру. 20 микромолярных ионов мицина для получения максимальной флуоресценции и пять миллимолярных хлоридов марганца для получения минимальной флуоресценции. Выполняйте анализ изображений в автономном режиме с помощью программного обеспечения IQ.

Нарисуйте области интереса или ROI вокруг каждой ячейки или части ячейки. Кроме того, выберите свободную от ячеек область для автоматического вычитания фона программным обеспечением. Затем для каждого ROI получается ряд интенсивности флуоресценции, и эти данные могут быть экспортированы в Microsoft Excel для дальнейшего анализа.

Прогестерон является одним из известных индукторов акросомной реакции и, как и ожидалось, провоцирует временное внутриклеточное увеличение концентрации кальция в сперме человека, измеренное с помощью обычной флуориметрии. Красная флуоресцентная кривая зависимости от времени показывает изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением четырех микромолярных прогестеронов в качестве отрицательного контроля HSM, что не вызвало никаких изменений внутриклеточных уровней концентрации кальция, на что указывает синяя флуоресцентная кривая в качестве положительного контроля. Изменение, вызванное мицином 10 микромолярных ионов, показано для каждого следа.

Добавление этого ионофора кальция приводит к максимальному увеличению концентрации кальция в клетках РА, который не возвращается к базальному уровню. Эта гистограмма показала среднее изменение флуоресценции дельта F при каждом условии, плюс-минус стандартная ошибка, где N равно трем, а звездочка указывает на значение P менее 0,001 по сравнению с контролем. Индуцированное прогестероном внутриклеточное увеличение концентрации кальция было измерено с большим временным разрешением с помощью флуориметрии с остановкой потока, и репрезентативные результаты приведены здесь.

Исходные следы показаны на панели А, как прогестерон, представленный красной линией, так и ионный мицин, представленный синей линией, вызвали быстрое внутриклеточное увеличение концентрации кальция. Зеленый след — это отрицательный контроль, когда клетки были смешаны с HSM. На панели В показаны скорректированные следы сигналов, индуцированных прогестероном или ионным мицином, полученными путем вычитания управляющего сигнала из соответствующих им исходных сигналов.

Прогестерон вызывал очень быстрое и преходящее повышение внутриклеточной концентрации кальция с максимальным значением флуоресценции, возникающим через 2,7 секунды после добавления индуктора. С другой стороны, ЦИН вызывал быстрое и устойчивое повышение внутриклеточной концентрации кальция в течение 50 секунд. На врезке на панели B показано расширенное представление первых 500 миллисекунд для каждого ответа.

Отсутствие задержки внутриклеточного повышения концентрации кальция, вызванного прогестероном, согласуется с предыдущими сообщениями, предполагающими, что прогестерон напрямую активирует кошачью шпору кальциевого канала без промежуточной сигнализации. Внутриклеточную концентрацию кальция также измеряли в емкостной и неемкой сперме человека с помощью проточной цитометрии. В этих репрезентативных диаграммах смещения вперед и сбоку.

Емкостные элементы выделены синим цветом, а неемкостные — красным. Выбранный вентиль обозначен синей линией, и для дальнейшего анализа использовались только ячейки в этой области. На панели B показана гистограмма флуоресценции в канале Fitzy от Unstained, сперматозоидов, а на панели D показана гистограмма флуоресценции в канале FZ от сперматозоидов, окрашенных гриппом в 3:00 AM, как это наблюдается на панели D. Распределение значений флуоресценции для емкостных сперматозоидов, представленных синей кривой, смещено в сторону более высоких значений по сравнению с неемкостными сперматозоидами, представленными красной кривой.

На панели C показана гистограмма флуоресценции в канале PI из неокрашенных клеток, а на панели E показана гистограмма флуоресценции в канале PI из мертвых клеток. Значения флуоресценции для каждой отдельной клетки можно наблюдать на показанных здесь двумерных точечных графиках флуоресценции. Для неокрашенных клеток и клеток, дважды окрашенных гриппом в 3:00 AM и pi, процент клеток, зарегистрированных в каждом квадранте, обозначен красным числом.

Важно отметить, что сигнал, исходящий от мертвых клеток, может быть устранен. Наконец, индуцированное прогестероном внутриклеточное изменение концентрации кальция измеряли в одиночных сперматозоидах путем визуализации этих репрезентативных псевдоцветных изображений, показывающих клетки, визуализированные в начале и после добавления прогестерона, ЦИН и хлорида марганца. Добавление прогестерона вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция, как в головке сперматозоида, так и в хлориде марганца, используемом для снижения заболеваемости гриппом.

На этом рисунке показана флуоресценция в 3:00 AM путем гашения репрезентативных нормализованных следов флуоресценции девяти отдельных клеток из эксперимента. Как наблюдалось в популяционных экспериментах, анализ отдельных клеток выявил переходное и устойчивое повышение прогестерона и ионного мицина соответственно. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о проверке жизнеспособности клеток и выполнении соответствующих контрольных действий после этой процедуры. Другие методы, такие как электрофизиология, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как идентификация специфических ионных каналов, участвующих в увеличении кальция, с использованием растворов Проппе и протоколов моделирования после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной физиологии к изучению динамики кальция в живых клетках с высоким пространственным и временным разрешением.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выбрать наиболее подходящую методику для измерения внутриклеточного повышения кальция с помощью флуоресцентного излучения в любом типе клеток, в зависимости от конкретного вопроса, на который вы хотели бы ответить. Не забывайте, что работа с человеческими образцами может быть опасной, и такие меры предосторожности, как использование доноров с доказанным здоровьем. Использование латексных шаров во время процедуры и соответствующая утилизация раствора и материалов всегда должны приниматься во время выполнения этой процедуры.