Измерение внутриклеточного Са

Общая цель данной процедуры заключается в измерении колебаний уровня внутриклеточного кальция в сперматозоидах человека с помощью флуоресцентных красителей. Для этого сначала подготавливают образец спермы методом «swim-up» и, при необходимости, стимулируют процесс капацитации. Вторым этапом является загрузка сперматозоидов флуоресцентным красителем на кальций.

Затем, используя стандартную флуориметрию, флуориметрию с остановленным потоком, проточную цитометрию или визуализацию отдельных клеток, проведите эксперимент и зарегистрируйте показатели содержания кальция. В конечном итоге результаты анализируются для определения изменений внутриклеточных концентраций кальция, вызванных прогестероном или происходящих в процессе капацитации. Главным преимуществом данного метода перед существующими способами, например, с использованием радиоактивных изотопов, является его высокая чувствительность.

Метод безопасен и прост в исполнении. Он позволяет ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов кальция в SPR, такие как идентификация соединений, вызывающих повышение уровня внутриклеточного кальция с высоким пространственным и временным разрешением, а также определение различных клеточных субпопуляций в образце семени. Применение, например, метода проточной цитометрии имеет значение для диагностики проблем с фертильностью посредством анализа физиологического состояния мужских гамет.

Несмотря на то, что данный метод позволяет получить ценные сведения при изучении мобилизации кальция в сперматозоидах человека, он также может быть применен к другим типам клеток, таким как мужские гаметы других видов или иные типы клеток, например, нейроны или мышечные клетки. Как правило, специалисты, использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку работа со сперматозоидами осложнена и крайне важно поддерживать надлежащие условия для сохранения жизнеспособности и подвижности клеток на протяжении всего эксперимента. Мы реализовали применение этих методов, объединив стратегии из различных областей.

Визуальная демонстрация данного метода имеет важное значение, так как подготовка и обработка образца, а также введение соединений трудно поддаются освоению, поскольку сперматозоиды могут быть повреждены в ходе процедуры, а при добавлении соединений могут возникнуть артефакты в ответах. Для подготовки образца спермы необходимо осторожно наслоить один миллилитр среды hams F 10 поверх каждых 500 мкл разжиженной семенной жидкости Eloqua, коснувшись кончиком микропипетки стенки пробирки и аккуратно распределив среду над образцом.

Крайне важно выполнять эту процедуру медленно, чтобы избежать смешивания слоев образца и среды. Среду дополняют хлоридом кальция в концентрации 2 мМ и BSA в концентрации 5 мг/мл. Для стимуляции капацитации in vitro осторожно наклоните пробирки под углом примерно 30 градусов.

Это увеличит площадь поверхности раздела между двумя жидкостями, тем самым улучшая вытеснение или всплывание сперматозоидов из образца в среду во время инкубации. Затем поместите наклонные пробирки в инкубатор при 37 °C и составе газа 5% carbon dioxide и 95% air на один час.

С помощью микропипетки осторожно отберите из каждой пробирки верхние 700 µL среды hams F 10, содержащей подвижные сперматозоиды. Объедините все собранные образцы в одну чистую стеклянную пробирку, избегая образования пузырьков. Нанесите 10 µL объединенного образца на плоское оптическое стекло основания счетной камеры Макулака и накройте его покровным стеклом.

Следите за тем, чтобы внутри камеры не образовывались пузырьки воздуха, так как это приведет к неточному подсчету клеток. Проведите наблюдение с помощью светового микроскопа, оснащенного объективом 20x. На покровном стекле камеры для подсчета клеток (камеры Макулара) расположен большой квадрат, состоящий из 100 меньших квадратов.

Подсчитайте количество клеток в любой полоске из 10 квадратов. Это число представляет концентрацию клеток в миллионах клеток на миллилитр. Повторите подсчет в двух дополнительных полосках по 10 квадратов и вычислите среднее значение трех подсчетов для последующей загрузки клеток флуоресцентным красителем.

В пробирке для центрифугирования объемом 1,5 мл смешайте необходимый объем суспензии сперматозоидов с достаточным количеством стокового раствора Fluo-3 AM с концентрацией 1 мМ, чтобы получить конечную концентрацию Fluo-3 AM 2 мкМ. Инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C в защищенном от света месте, затем центрифугируйте пробирку при 750 ×g в течение пяти минут. Образование «облака» вместо плотного осадка указывает на хорошее состояние клеток. Отсосите и удалите супернатант, затем ресуспендируйте осадок в соответствующем объеме среды для человеческих сперматозоидов (HSM). Для начала эксперимента в стеклянной пробирке с плоским дном смешайте 570 мкл HSM и 30 мкл суспензии сперматозоидов, предварительно нагруженных Fluo-3 AM и ресуспендированных в HSM до концентрации 1 × 10⁸ клеток/мл.

Поместите магнитный перемешиватель внутрь стеклянной кюветы и вставьте кювету в измерительную камеру спектрометра, предварительно нагретую до 37 °C. Образец должен перемешиваться на протяжении всего времени регистрации данных. Запустите эксперимент с помощью программного обеспечения oli и приступите к измерению значений флуоресценции с частотой 0.5 Гц в течение 300 секунд.

После регистрации базовой флуоресценции в течение 30 секунд с помощью микрошприца Hamilton введите соответствующий объем исследуемого соединения — в данном случае прогестерона в концентрации 20 мкМ на 100-й секунде. В качестве положительного контроля для получения максимального значения флуоресценции используйте иономицин в концентрации 20 мкМ. В данном эксперименте изменения концентрации внутриклеточного кальция измеряются с высоким временным разрешением.

Используя смеситель с остановленным потоком SFM 20, соединенный с оптической системой для изучения быстрой кинетики, заполните один из шприцев прибора одним миллилитром загруженных сперматозоидов (flu. 3:00 AM), а второй шприц — одним миллилитром тестируемого соединения: 20 µM прогестерона, растворенного в HSM.

В данном примере крайне важно избегать образования пузырьков при наборе жидкостей в шприцы. Поднимите поршни обоих инструментов до тех пор, пока они не коснутся наконечников плунжеров шприцев. Установите общее время отбора проб в данном случае на 50 секунд, а частоту — на 10 миллисекунд, чтобы минимизировать повреждение клеток; установите скорость потока на минимальное значение, которое обеспечит измеримый триггер отклика.

После смешивания реагентов на экране компьютера будет отображаться график зависимости интенсивности сырой флуоресценции от времени. Повторите эту процедуру, заменив прогестерон на HSM в качестве отрицательного контроля и 10 µM иономицина в качестве положительного контроля перед проведением проточной цитометрии. Подготовьте экспериментальные образцы, поместив по 500 µL клеточной суспензии в каждую пробирку для цитометра для каждого тестируемого условия.

Настройте эксперимент с помощью программного обеспечения оборудования. Сначала создайте новую папку, образец эксперимента и укажите количество пробирок. Затем выберите соответствующие настройки цитометра для flu O 3:00 AM. Используйте фильтры для флуоресцеинизотицианата и пропидия иодида.

Пропустите неокрашенные контрольные пробы один и два через цитометр. Соберите данные прямого и бокового светорассеяния, чтобы проверить правильность настроек порога и создать соответствующий гейт для отделения клеточного дебриса от клеток. Проанализируйте экспериментальные пробы и соберите данные флуоресценции по 10 000 событий для каждого образца.

В завершение экспортируйте все данные в программное обеспечение, предназначенное для анализа. Подготовьте круглые покровные стекла, необходимые для данной процедуры, нанеся каплю 5 µL раствора поли-L-лизина в центр каждого стекла.

Оставьте минимум на один час перед использованием, затем промойте обработанную область водой. Это позволит удалить излишки полилизина и обеспечит прикрепление сперматозоидов к покровному стеклу за счет их головок, при этом жгутики сохранят подвижность. Установите покровное стекло внутри регистрационной камеры.

Нанесите 10 µL суспензии клеток, загруженных flu oh 3:00 AM, в концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл, в центр покровного стекла. Покройте клетки 200 µL предварительно подогретого HSM.

Поместите кювету на предметный столик микроскопа, предварительно нагретого до 37 °C, и рассмотрите клетки, используя фазовый контраст. Выберите область, где плотность клеток подходит для визуализации. Слишком большое количество клеток затрудняет анализ из-за перекрытия сигналов.

Клетки должны быть плотно прикреплены к покровному стеклу головками, но при этом сохранять подвижность жгутиков, что подтверждает их жизнеспособность. Начните эксперимент, активировав программное обеспечение для получения серии изображений во времени. Обычно требуется четыре изображения в секунду с временем освещения две миллисекунды на каждое изображение.

Получайте изображения флуоресценции в режиме реального времени. Отрегулируйте фокус и яркость. С помощью микропипетки осторожно добавьте по каплям исследуемое соединение (в данном случае прогестерон) и продолжайте получение изображений по мере необходимости.

Выполните два последовательных контрольных добавления в одну и ту же камеру: 20 µM иономицина для получения максимальной флуоресценции и 5 mM хлорида марганца для получения минимальной флуоресценции. Проведите анализ изображений в автономном режиме с помощью программного обеспечения IQ.

Очертите области интереса (ROI) вокруг каждой клетки или ее части. Кроме того, выберите область, свободную от клеток, для автоматического вычитания фона программным обеспечением. Затем для каждого ROI получается серия временных показателей интенсивности флуоресценции; эти данные могут быть экспортированы в Microsoft Excel для дальнейшего анализа.

Прогестерон является одним из известных индукторов акросомальной реакции и, как и ожидалось, вызывает кратковременное повышение внутриклеточной концентрации кальция в сперматозоидах человека, что было измерено методом традиционной флуориметрии. График красной флуоресценции в зависимости от времени демонстрирует изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением 4 µM прогестерона; в качестве отрицательного контроля была добавлена HSM, которая не вызвала никаких изменений уровней внутриклеточной концентрации кальция, что показано графиком синей флуоресценции. В качестве положительного контроля для каждого графика показано изменение, вызванное 10 µM иономицина.

Добавление этого ионофора кальция вызывает максимальное увеличение концентрации клеточного кальция в RA, которая не возвращается к базальному уровню. На данной столбчатой диаграмме показано среднее изменение флуоресценции delta F для каждого условия, плюс или минус стандартная ошибка, где N равно трем, а звездочка указывает на значение P менее 0,001 по сравнению с контролем. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция, индуцированное прогестероном, было измерено с более высоким временным разрешением с помощью флуориметрии в режиме остановленного потока; соответствующие результаты представлены здесь.

На панели A представлены необработанные кривые записи: как прогестерон (обозначен красной линией), так и иономицин (обозначен синей линией) вызвали быстрое увеличение внутриклеточной концентрации кальция. Зеленая кривая представляет собой отрицательный контроль, где клетки смешивали с HSM. На панели B показаны скорректированные кривые сигналов, индуцированных прогестероном или иономицином, полученные путем вычитания контрольного сигнала из соответствующих необработанных сигналов.

Прогестерон вызвал очень быстрый и кратковременный рост внутриклеточной концентрации кальция с максимальным значением флуоресценции через 2,7 секунды после добавления индуктора. С другой стороны, CIN вызвал быстрый и устойчивый рост внутриклеточной концентрации кальция на протяжении 50 секунд. Вставка на панели B представляет собой увеличенный вид первых 500 миллисекунд для каждого ответа.

Отсутствие задержки при увеличении внутриклеточной концентрации кальция, индуцированном прогестероном, согласуется с предыдущими данными, свидетельствующими о том, что прогестерон напрямую активирует кальциевый канал CatSper без участия промежуточных сигнальных путей. Внутриклеточная концентрация кальция также была измерена в капацитированных и некапацитированных сперматозоидах человека с помощью проточной цитометрии. На данных репрезентативных графиках прямого и бокового светорассеяния.

Капацитированные клетки отмечены синим цветом, некапацитированные — красным. Выбранное окно (гейт) обозначено синей линией; для дальнейшего анализа использовались только клетки, находящиеся в этой области. На панели B представлена гистограмма флуоресценции в канале Fitzy для неокрашенных сперматозоидов, а на панели D — гистограмма флуоресценции в канале FZ для окрашенных сперматозоидов, как показано на панели D. Распределение значений флуоресценции для капацитированных сперматозоидов (синий контур) смещено в сторону более высоких значений по сравнению с некапацитированными сперматозоидами (красный контур).

На панели C представлена гистограмма флуоресценции в канале PI для не окрашенных клеток, а на панели E — гистограмма флуоресценции в канале PI для мертвых клеток. Значения флуоресценции для каждой отдельной клетки можно увидеть на представленных здесь двухмерных точечных диаграммах флуоресценции. Для не окрашенных клеток и клеток с двойным окрашиванием flu oh 3:00 AM и pi процент клеток, зарегистрированных в каждом квадранте, указан красным числом.

Важно отметить, что сигнал от погибших клеток может быть устранен. Наконец, изменение внутриклеточной концентрации кальция, индуцированное прогестероном, измеряли в отдельных сперматозоидах с помощью визуализации; на этих репрезентативных псевдоцветных изображениях показаны клетки в начале исследования и после добавления прогестерона, CIN и хлорида марганца. Добавление прогестерона вызывает увеличение внутриклеточной концентрации кальция как в головке сперматозоида, так и в люмен; хлорид марганца используется для снижения флуоресценции.

На этом рисунке представлены репрезентативные нормализованные кривые флуоресценции девяти отдельных клеток, полученные методом гашения флуоресценции в 3:00 утра. Как и в экспериментах на популяциях, анализ единичных клеток выявил транзиторное и устойчивое увеличение сигнала для прогестерона и иономицина соответственно. После освоения эта методика может быть выполнена за три-четыре часа при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно не забывать проверять жизнеспособность клеток и проводить соответствующие контрольные эксперименты после завершения процедуры. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, для идентификации специфических ионных каналов, участвующих в повышении уровня кальция, после разработки метода можно использовать такие подходы, как электрофизиология, с применением подходящих растворов и протоколов стимуляции. Эта методика открыла исследователям в области физиологии клетки возможность изучать динамику кальция в живых клетках с высоким пространственным и временным разрешением.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выбрать наиболее подходящий метод измерения повышения уровня внутриклеточного кальция с использованием флуоресцентного красителя в любом типе клеток, в зависимости от конкретного вопроса, на который вы хотите получить ответ. Не забывайте, что работа с образцами семени человека может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование доноров с подтвержденным состоянием здоровья, применение латексных перчаток и надлежащая утилизация растворов и материалов.