Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры заключается в измерении кинетики и прогрессии клеточного цикла. Первые клетки подвергаются пульсовой погоне, меченной ромо, дезокси, уридином или BRDU, который встраивается в клеточную ДНК вместо тимидина. Затем клетки иммуноокрашивают антителами против BRDU и анализируют с помощью проточной цитометрии сразу после окрашивания.

Только клетки в S-фазе помечаются по мере того, как помеченные клетки продвигаются через клеточный цикл до G два. Они обнаруживаются как имеющие содержание четырех NDNA после митоза. Содержание ДНК уменьшается до двух N. Таким образом, анализ профилей флуоресценции, полученных с помощью проточной цитометрии, может быть использован для определения кинетики прогрессии клеточного цикла.

Основное преимущество этого метода перед другими протоколами, в которых используются химические вещества для синхронизации клеток, заключается в том, что нет физиологических возмущений, которые могли бы непреднамеренно повлиять на механизм деления клеток. Впервые мы воспользовались этим методом, когда наши попытки изучить скорость развития клеточного цикла с помощью химической синхронизации дали нам неожиданные результаты, которые помешали нашему анализу. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии.

Например, на чем основана разница в скорости роста между различными типами клеток? Начните этот протокол с импульсной маркировки клеток BRDU для этого. Начните с маркировки одной 10-сантиметровой таблички для каждой временной точки плюс одна для каждого из следующих элементов управления.

BRDU только PI только BRDU отрицательный PI отрицательный посев каждой пластины пятью умножить на 10 до пятого. Семь клеток MCF в дополненном DMEM инкубируют в планшетах в течение 24-48 часов, чтобы позволить клеткам восстановиться и прикрепиться. Как только клетки достигнут 60% плавности, замените среду свежей DMEM, содержащей 10 микромоляров.

BRDU инкубируют клетки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия 5% CO2, чтобы обеспечить включение BRDU в ДНК. Обязательно оставьте одну пластину необработанной, чтобы она действовала как отрицательный контроль или нулевая временная точка через один час. Удалите среду для импульсной маркировки и кратковременно промойте клетки PBS до двух-восьмичасовых временных точек.

Добавьте свежую среду для роста и поместите их обратно в инкубатор. Затем немедленно соберите нулевую и одну часовую временные точки, как описано в следующем разделе. Чтобы собрать клетки, отсадите среду и промойте пластину.

После того, как с помощью PBS, трипсин просматривает клетки, чтобы отделить их от планшета и собрать в центрифуге DMEM при трех 90-кратных Gg в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Затем промойте клетки в ледяной центрифуге PBS от одного до пяти миллилитров при температуре 90 раз G в течение пяти минут после отжима, выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в ста микролитрах льда.

Холодный PBS, содержащий 1% FBS. FBS помогает предотвратить слипание клеток. Одним из наиболее важных аспектов этой процедуры является обеспечение того, чтобы у вас была суспензия одной клетки из собранных клеток.

За фактами. Чтобы добиться этого, вы можете добавлять свои клетки непосредственно в этанол по каплям. Это очень важно: Далее, чтобы зафиксировать клетки, с помощью пипетки добавьте в ячейки по каплям до пяти миллилитров ледяного кода.

70% этанола в конической трубке объемом 15 миллилитров. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут или храните их при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Это идеальный шаг, на котором для остановки сбора образцов из различных временных точек образцы могут быть оставлены в этаноле на несколько дней, что позволяет одновременно обрабатывать их через оставшуюся часть протокола для выполнения окрашивания BRDU и йодидом пропидия.

Снимите клетки с температуры четыре градуса Цельсия и центрифугируйте их при температуре 90 градусов G в течение пяти минут. Следом за спином отсасывайте большую часть фиксатора, оставляя около 50 микролитров. Затем вихрь.

Чтобы разрыхлить гранулу, денатурировать ДНК во время вортекса. Медленно добавьте один миллилитр двух обычных HCL Triton X 100 по каплям, затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. Грануляторы клеток путем центрифугирования образцов в течение пяти минут при трех 90-кратных G затем отсасывают и отбрасывают надосадочную жидкость.

Затем ресуспендируют клеточную гранулу в одном миллилитре 0,1 моляра тетрабората натрия. После центрифугирования клетки снова отсасываются и отбрасывают надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 75 микролитрах окрашивания BRDU.

Смесь инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут, в защищенном от света месте после инкубации. Гранулируйте клетки центрифугированием, как и раньше, и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS, содержащем пять микрограммов на миллилитр на йодид пердия. При прогоне положительного ПИ образца через проточный цитометр создайте диаграмму прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния, чтобы обеспечить правильное распределение клеток по размерам.

Оба этих параметра должны быть отображены в линейном масштабе. Одновременно просмотрите график зависимости FL три H от FL two W, чтобы увидеть зависимость окрашивания PI от длительности импульса флуоресценции. Этот график используется для создания походки для выделения доли клеток, которые, как считается, находятся в пределах нормальной модели распределения клеточного цикла.

В целом, эта схема распределения характеризуется двумя кластерами клеток из двух N и четырех NDNA, содержащих окрашивание PI, представляющих G-1 и G-2 фазы клеточного цикла, соответственно. Цепочка клеток, расположенная между этими двумя кластерами, является репрезентативной для продолжающейся репликации ДНК, которая происходит в S-фазе клеточного цикла. Создание графика с отображением стробируемых ячеек с FL one H или FITC на логарифмической шкале по оси Y и PI на линейной шкале по оси X.

Этот график будет использоваться для установки остальных параметров с помощью различных элементов управления, а также для сбора данных. Для анализа поместите образец только окрашивания PI в загрузочное отверстие проточного цитометра, отрегулируйте усиление так, чтобы G 1 находился примерно на 200 по оси x. Это будет легче визуализировать на гистограмме пятна PI.

Затем поместите образец только BRDU в порт загрузки и запустите. Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы на графике появились две популяции клеток, BRDU положительная и BRDU отрицательная. В идеале отрицательные ячейки BRDU располагаются на расстоянии чуть ниже 10 к единице.

Окончательным контролем является отрицательный образец BDU slash PI. Запустите этот отрицательный контроль, чтобы убедиться, что ячейки не появляются ни в верхнем, ни в правом квадрантах. После того, как параметры различных графиков установлены, проточный цитометр калибруется и готов к обработке BRDU и PI. Окрашенные клетки собирают данные минимум от 10 000 PI-гейтированных клеток для каждого образца.

Затем с помощью программного обеспечения, такого как FlowJo или fax diva, создайте график зависимости FITC от PI с ячейками, стробированными как положительные PI из графика PI и FL 2 W. Для различения велосипедного населения. Затем сгенерируйте второй вентиль для изоляции популяции BRDU, положительной популяции.

Затем, чтобы отследить временной ход прогрессии клеточного цикла, построите график количества BRDU-положительных клеток с содержанием G 1 или G 2 в зависимости от времени, чтобы сравнить клеточный цикл прогрессии. Кинетика между двумя линиями колоректальных клеток HT 29 и LS 180. Клетки собирали каждый час в течение восьми часов после удаления пульса A-B-R-D-U.

Сравнивая кинетику двух профилей, можно увидеть, что возникновение пика G one очевидно при t, равном четырем часам после BRDU в ячейках LS 180, по сравнению с соответствующей временной точкой для клеточной линии HT 29, в которой этот пик отсутствует. Это указывает на ускоренное прогрессирование клеточного цикла через фазу G-2 клеточного цикла. В колоректальной клеточной линии LS 180 генерировать циклический профиль клеточной линии рака молочной железы.

Каждый час в течение восьми часов собирали семь клеток МС. После удаления импульса BRDU. Затем меченые иммуно клетки и клетки контрокрашивания ДНК были отсортированы на основе их флуоресцентных сигналов.

Как можно видеть здесь, семь клеток CF циклировались значительно медленнее, чем любая из двух протестированных линий колоректальных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как метаболическое мечение ДНК в сочетании с сбором урожая во временных точках позволяет отслеживать кинетику клеточного цикла.