Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Общая цель следующей процедуры заключается в измерении кинетики и прогрессии клеточного цикла. Сначала клетки подвергаются импульсно-погоняльному мечению с помощью romo, deoxy, уридина или BRDU, который встраивается в ДНК клетки вместо тимидина. Затем клетки подвергаются иммуноокрашиванию антителами к BRDU и анализируются с помощью проточной цитометрии сразу после окрашивания.

Метки ставятся только клеткам в S-фазе; по мере прохождения через клеточный цикл меченые клетки переходят в фазу G2. После митоза они определяются как клетки с содержанием ДНК 4N. Содержание ДНК снижается до 2N. Таким образом, анализ профилей флуоресценции, полученных с помощью проточной цитометрии, может быть использован для определения кинетики прохождения клеточного цикла.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими протоколами, в которых для синхронизации клеток используются химические вещества, является отсутствие физиологических нарушений, которые могли бы непреднамеренно повлиять на аппарат клеточного деления. Мы впервые применили этот метод, когда наши попытки изучить скорость прохождения клеточного цикла с помощью химической синхронизации привели к неожиданным результатам, которые помешали анализу. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области клеточной биологии.

Например, что лежит в основе различий в скорости роста разных типов клеток? Чтобы выяснить это, начните выполнение данного протокола с импульсного мечения клеток BrDU. Для начала промаркируйте одну 10-сантиметровую чашку для каждой временной точки, а также по одной чашке для каждого из следующих контролей.

Только BrdU, только PI, BrdU-отрицательные, PI-отрицательные; в каждую лунку высейте 5 × 10⁵ клеток MCF-7 в supplemented DMEM. Инкубируйте планшеты от 24 до 48 часов, чтобы клетки успели восстановиться и прикрепиться. Когда клетки достигнут 60% конфлюэнтности, замените среду на свежий DMEM, содержащий 10 µM.

Инкубируйте клетки с BrdU в течение одного часа при 37 °C и 5% CO2 для обеспечения включения BrdU в ДНК. Обязательно оставьте одну планшетку необработанной в качестве отрицательного контроля или нулевой временной точки спустя один час. Удалите среду для импульсной метки и коротко промойте клетки PBS перед переходом к временным точкам от двух до восьми часов.

Добавьте свежую ростовую среду и поместите их обратно в инкубатор. Затем немедленно соберите клетки из планшетов для временных точек «ноль» и «один час», как описано в следующем разделе. Чтобы собрать клетки, аспирируйте среду и промойте планшет.

Сначала промойте клетки PBS, затем добавьте трипсин, чтобы открепить клетки от планшета, и соберите их в DMEM; центрифугируйте при 390 ×g в течение пяти минут. Удалите супернатант. Затем промойте клетки в 1–5 мл ледяного PBS, центрифугируя при 390 ×g в течение пяти минут; после центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 100 µL ледяного раствора.

Холодный PBS, содержащий 1% FBS. FBS помогает предотвратить слипание клеток. Одним из наиболее важных аспектов данной процедуры является обеспечение получения суспензии из одиночных клеток из собранного клеточного материала.

Для фиксации. Чтобы этого добиться, можно добавлять клетки непосредственно в этанол по каплям. Это имеет решающее значение. Затем для фиксации клеток с помощью пипетки по каплями добавьте клетки в пять миллилитров ледяного раствора.

70% этанол в конической пробирке объемом 15 миллилитров. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут или храните их при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. Это оптимальный этап для приостановки сбора образцов из различных временных точек; образцы могут оставаться в этаноле в течение нескольких дней, что позволяет обрабатывать их одновременно на последующих этапах протокола при проведении окрашивания BrDU и пропидийиодидом.

Извлеките клетки из среды с температурой 4 °C и центрифугируйте их при 90 ×g трижды по пять минут. После центрифугирования аспирируйте большую часть фиксатора, оставив около 50 µL. Затем перемешайте на вортексе.

Чтобы разрыхлить осадок для денатурации ДНК при перемешивании на вортексе, медленно, по каплям, добавьте 1 mL 2N HCl Triton X 100, затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадите клетки, центрифугируя образцы в течение 5 минут при 390 ×g, после чего аспирируйте и удалите супернатант.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в одном миллилитре 0,1 молярного тетрабората натрия. После центрифугирования снова аспирируйте и удалите супернатант. Затем ресуспендируйте осадок клеток в 75 µL раствора для окрашивания BrdU.

Перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут, защищая от света после инкубации. Осадите клетки центрифугированием, как описано ранее, и ресуспендируйте клеточный осадок в одном миллилитре PBS, содержащего пять микрограмм на миллилитр пропидия иодида. При анализе образца, положительного по PI, на проточном цитометре, постройте график прямого светорассеяния в зависимости от бокового светорассеяния, чтобы убедиться в правильном распределении клеток по размеру.

Оба этих параметра следует отображать в линейном масштабе. Одновременно с этим просмотрите график зависимости FL three H от FL two W, чтобы сопоставить окрашивание PI с шириной флуоресцентного импульса. Этот график используется для создания гейта с целью выделения фракции клеток, которые, как считается, находятся в пределах нормального распределения клеточного цикла.

В целом, такая картина распределения характеризуется наличием двух кластеров клеток с содержанием PI, соответствующим 2N и 4N количеству ДНК, что представляет фазы G1 и G2 клеточного цикла соответственно. Группа клеток, расположенная между этими двумя кластерами, представляет собой клетки в процессе репликации ДНК, которая происходит в S-фазе клеточного цикла. Постройте график, отображающий выделенные гейтом клетки, где по оси Y в логарифмическом масштабе отложен FL1 H или FITC, а по оси X в линейном масштабе — PI.

Этот график будет использоваться для настройки остальных параметров с помощью различных органов управления, а также для сбора данных. Для анализа поместите образец, окрашенный только PI, в загрузочный порт проточного цитометра и отрегулируйте усиление так, чтобы G1 находился примерно на отметке 200 по оси x. Это будет проще визуализировать на гистограмме окрашивания PI.

Затем поместите образец, содержащий только BRDU, в порт загрузки и запустите анализ. Отрегулируйте усиление так, чтобы на графике отобразились две популяции клеток: BRDU-положительные и BRDU-отрицательные. В идеале BRDU-отрицательные клетки должны располагаться на уровне 10¹ или чуть ниже.

Заключительный контроль — это отрицательный образец BDU/PI. Проведите этот отрицательный контроль, чтобы убедиться, что клетки не попадают ни в один из верхних или правых квадрантов. После настройки параметров всех графиков проточный цитофлуориметр будет откалиброван и готов к анализу клеток, окрашенных BrDU и PI. Для каждого образца следует собрать данные минимум по 10 000 клеток, прошедших через гейт по PI.

Затем, используя такое программное обеспечение, как FlowJo или fax diva, постройте график зависимости FITC от PI, используя гейт PI-положительных клеток, определенный на графике PI против FL two W, чтобы выделить популяцию делящихся клеток. После этого создайте второй гейт для изоляции BRDU-положительной популяции.

Затем, чтобы отследить временной ход прохождения клеточного цикла, постройте график зависимости количества BrDU-положительных клеток с содержанием ДНК, соответствующим фазам G1 или G2, от времени для сравнения кинетики клеточного цикла между двумя линиями колоректальных клеток HT 29 и LS 180. Сбор клеток проводили каждый час в течение восьми часов после удаления BrDU-импульса.

При сравнении кинетики двух профилей видно, что в клетках LS 180 через четыре часа после введения BRDU появляется пик G1, в то время как в клетке линии HT 29 в соответствующей временной точке этот пик отсутствует. Это указывает на ускоренное прохождение клеточного цикла через фазу G2. В колоректальной клеточной линии LS 180 для создания профиля цикла клеточной линии рака молочной железы.

Клетки MC семь собирали каждый час в течение восьми часов после удаления импульса BRDU. Затем иммуномаркированные клетки с контрастированием ДНК сортировали на основе их флуоресцентных сигналов.

Как видно здесь, клетки CF seven делились значительно медленнее, чем любая из двух протестированных линий клеток колоректального рака. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как метаболическое маркирование ДНК в сочетании со сбором образцов в определенные моменты времени позволяет отслеживать кинетику клеточного цикла.