На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию

В данном видео представлена серия из четырех экспериментов, используемых для идентификации функциональных мотивов белка NEF ВИЧ-1 и разработки пептидных ингибиторов. Специфические короткие пептиды, полученные из мотивов полноразмерных белков, сохраняют свою биологическую функцию и конкурентно ингибируют функцию полноразмерного белка для идентификации апоптотических мотивов. Для белка NEF ВИЧ-1 клетки Jurkat подвергаются воздействию сканирующих пептидов NEF, после чего проводится TUNEL-анализ на апоптоз для выявления пептидов, индуцирующих апоптоз.

Второй набор пептидов содержит варианты мотива секреции NEF. Область модификации секреции или SMR трансфецируют в клетки вместе с NPH GFP; потеря функции вследствие конкурентного ингибирования проявляется снижением секреции nph. GFP оценивают с помощью флуориметрии для идентификации клеточных факторов, которые взаимодействуют с областью модификации секреции или SMR белка nef.

Осаждение ко-иммунопреципитации проводят с использованием NPH дикого типа SMR в качестве приманки. Наконец, чтобы проверить, влияют ли эти взаимодействия на секрецию, в клетки трансфецируют антитела к идентифицированным партнерам по связыванию. Для оценки того, препятствуют ли они секреции мотива NF, полученные результаты позволяют выявить два функциональных апоптотических мотива в NEF и ингибирующий пептид, который подавляет функциональный мотив секреции NEF, а также его клеточные партнеры по связыванию, необходимые для секреции.

Общая цель данной серии из четырех экспериментов заключается в ускорении идентификации функциональных мотивов в белках-мишенях с последующим использованием этих данных для разработки пептидных ингибиторов данных функциональных мотивов. Этот набор протоколов помог нашей группе ответить на ключевые вопросы, касающиеся патогенеза ВИЧ, такие как понимание роли секреции, индуцируемой neff, в патогенезе, и расшифровка механизмов, лежащих в основе способности neff манипулировать путем экзосомального транспорта. Сегодня процедуры продемонстрирует д-р Мин Бо Хуан, научный сотрудник моей лаборатории.

Начните выполнение данной процедуры с набора пептидов, сканирующих область интереса для данного эксперимента. 20-мерные пептиды с перекрытием в 10 аминокислот, охватывающие весь белок NPH ВИЧ-1, были получены в рамках программы по реагентам для борьбы со СПИДом. Для идентификации апоптотических мотивов NPH проведите анализ апоптоза, используя сканирующие пептиды NEF по отдельности следующим образом: добавьте один миллилитр культуральной среды, содержащей 10 ng/ml пептида, на одну 35-мм чашку с культурами клеток jerk hat и инкубируйте культуры в течение 24 часов при 37 °C.

После инкубации проведите финальный анализ TUNEL или метод дезоксинуклеотидтрансферазы с использованием DUTP и биотинового никирования для оценки апоптоза. Для этого сначала промойте клетки раствором PBS, затем аспирируйте PBS и добавьте 4% раствор параформальдегида в PBS; инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре для фиксации клеток. После фиксации промойте клетки раствором PBS и добавьте Triton X 100, затем инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре для пермеабилизации. После фиксации и пермеабилизации клеток добавьте реагент для TUNEL и инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 °C.

Дважды промойте клетки раствором PBS. Затем определите процент окрашенных клеток методом эпифлуоресценции с использованием микроскопической системы с компьютерным управлением. После трансфекции клеток jca NPH, плазмидой GFP и различными вариантами пептида SMR с использованием набора реагентов для доставки белков chariot, как описано в прилагаемом документе, соберите среду для определения эффективности трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.

Получите изображения в режиме флуоресценции и светлого поля, затем определите процент клеток. Для оценки ингибирования секреции NPH GFP трансфицированными клетками перенесите 100 µL бесклеточной кондиционированной среды в отдельные лунки черного 96-луночного микротитрационного планшета. Используйте флуориметр с длиной волны возбуждения 485 nm и длиной волны эмиссии 515 nm для измерения флуоресценции GFP в среде в относительных единицах флуоресценции.

После завершения считывания перенесите данные на ПК. Примите уровень флуоресценции GFP в контрольной среде за 100%. Затем сравните его с уровнем флуоресценции GFP в среде клеток, котрансфицированных различными SMR-пептидами, чтобы определить изменения в секреции NPH GFP. Ко-иммунопреципитация (co IP) для изоляции партнеров по связыванию с мотивом является сложным этапом.

Убедитесь, что во время инкубаций бусины тщательно перемешиваются, а на каждом этапе промывки с бусин удаляется максимально возможный объем жидкости. Культивируйте клетки jerk hat в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, при 37 °C в культуральном флаконе T 75; осадите клетки центрифугированием при 1000 ×g в течение 20 минут при 4 °C. Ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл PBS и перенесите его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Центрифугируйте при 1000 ×g в течение одной минуты. Затем ресуспендируйте осадок в 1 мл лизирующего буфера Anti-Flag путем осторожного пипетирования в микроцентрифуге.

Центрифугируйте суспензии при 2000 ×g в течение пяти минут и при 13 000 ×g в течение 10 минут. Для осаждения клеточного дебриса и ДНК соответственно соберите супернатант, который далее будет именоваться лизатом. После определения концентрации белка добавьте 1 mg белка лизата и 1 µg пептида SMR дикого типа или мутантного пептида SMR к 20 µL аффинного геля Anti-Flag M2.

Данный аффинный гель в дальнейшем именуется смолой; доведите смесь до конечного объема 1 mL буфером для ко-иммунопреципитации. Также подготовьте отрицательный контроль, в котором лизат смешивают со смолой в отсутствие обоих пептидов. Инкубируйте смеси при температуре 4 °C в течение ночи при вращении в режиме end-over-end.

На следующий день осадите смолу путем микроцентрифугирования при 5 000–8 000 ×g в течение 30 секунд. После центрифугирования подождите одну-две минуты перед работой с образцами, чтобы смола осела в пробирке. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки с узким концом или шприца Hamilton, стараясь не переносить смолу.

Промойте смолу четыре раза путем ресуспендирования в 500 µL промывочного буфера с последующим микроцентрифугированием. Для элюции связанных клеточных белков добавьте в пробирку 15 µg избытка пептида 3xFLAG в 50 µL промывочного буфера и инкубируйте на качалке в течение 30 минут при комнатной температуре; после инкубации центрифугируйте при 5 000–8 000 ×g в течение 30 секунд.

После того как пробирки постоят две минуты, соберите и сохраните супернатант, содержащий элюированные белки. После концентрирования EITs методом осаждения ацетоном, прокипятите образцы в буфере для образцов Laemmli. Затем разделите белки методом SDS-PAGE на предварительно приготовленном градиентном геле Tris-HCl (от 40 до 20%) и окрасьте гель красителем Coomassie Brilliant Blue R-250.

Для оценки ингибирования антителами проведите котрансфекцию клеток JCA с NGFP и либо анти-α-тубулином, либо анти-mortality антителом, используя набор реагентов для доставки белков chariot согласно описанию в сопроводительном документе; соберите бесклеточную кондиционированную среду из полученных клеток. Перенесите по 100 µL в отдельные лунки черного 96-луночного микротитрационного планшета. Затем измерьте флуоресценцию GFP в среде с помощью флуориметра при длине волны возбуждения 485 nm и длине волны эмиссии 515 nm в относительных единицах флуоресценции.

После считывания планшета перенесите данные на ПК и установите уровень флуоресценции GFP в контроле с анти-жировой тубулином на 100%. Сравните этот показатель с уровнем флуоресценции GFP в среде клеток, которые не были трансфицированы анти-летальным антителом, чтобы определить изменения в секреции NEF GFP. Для картирования апоптотических мотивов белков HIV-1 Nef был проведен пептидный сканирующий анализ, как описано в данном видео. Ось Y показывает процент TUNEL-положительных клеток, а ось X обозначает условия обработки. Как показано здесь, были выявлены два отдельных участка HIV-1 Nef, индуцирующих апоптоз. Они определяются по усилению TUNEL-маркировки клеток, подвергнутых воздействию пептидов Nef.

Пики апоптоза обозначены мотивом один и мотивом два для оценки конкурентного ингибирования секреции NPH пептидами дикого типа SMR. Культуральную среду T-клеток Jurkat, ко-трансфектированных клоном NPH-GFP и различными пептидами SMR, анализировали на экзомальную секрецию NPH по флуоресценции GFP в среде. Пептиды, содержащие один или несколько мотивов последовательности SMR NPH дикого типа, ингибировали экзомальную секрецию NPH, в то время как замена любой аминокислоты в этой области на аланин значительно снижала эффективность пептидов. Это говорит о том, что пептид SMR дикого типа ингибирует экзомальный NPH, который представляет собой перемешанную версию апоптотического мотива NPH из 11 аминокислот. SM1, описанный ранее и полученный из Sigma Genesis, использовали в качестве отрицательного контроля; он не оказал влияния на экзомальную секрецию NEP.

На данном изображении SDS-ПААГ-геля, окрашенного кумасси, показана коиммунопреципитация четырех белков с молекулярными массами 60, 65, 75 и 250 килДальтон с помощью SMR-пептида дикого типа. Отрицательный контроль с мутантным SMR-пептидом не захватил эти белки, и данные белки не вступали в неспецифическое взаимодействие с аффинной смолой. В отсутствие SMR-пептида дикого типа эти результаты позволяют предположить, что копреципитированные белки специфически взаимодействовали с SMR-мотивами SMR-пептида дикого типа.

Анализ с использованием планшетного ридера показывает, что совместная трансфекция антитела к mortal с плазмидой экспрессии neph полностью подавляет экзомальную секрецию NPH. Неродственное антитело не оказало влияния на экзомальную секрецию ne. Эти результаты позволяют предположить, что для экзомальной секреции neph необходимо полноценное взаимодействие между NM и talent.

В заключение, после просмотра этого видео вы должны сформировать четкое представление о том, как использовать методы описания для идентификации функциональных мотивов в целевых белках и как использовать эти данные для разработки пептидных ингибиторов данных функциональных мотивов. При выполнении процедуры ко-иммунопреципитации (co IP) крайне важно уделять пристальное внимание этапам промывки при инкубации, обеспечивая надлежащее перемешивание гранул в процессе инкубации и удаление максимально возможного количества жидкости с гранул на каждом этапе промывки. Также при промывке смолы в клеточных лизатах всегда давайте смоле осесть после центрифугирования.

Используйте наконечники для дозатора с узким отверстием и выполните четыре промывки, чтобы достаточно снизить уровень фонового сигнала до приемлемых значений.