На основе пептидов идентификации функциональных мотивов и их партнерами по связыванию

В этом видео представлена серия из четырех экспериментов, использованных для идентификации функциональных мотивов белка ВИЧ и одного белка NPH и для разработки ингибиторов на основе пептидов. Специфические короткие пептиды, полученные из мотивов, обнаруженных в полноразмерных белках, сохраняют свою биологическую функцию и конкурентно ингибируют функцию полноразмерного белка для идентификации апоптотических мотивов. При ВИЧ одну кошачью клетку NEF подвергают воздействию сканирующих пептидов NEF, и проводится туннельный апоптотический анализ для идентификации пептидов, вызывающих апоптоз.

Второй набор пептидов, содержащий вариации на тему секреции NEF. Область модификации секреции или SMR трансфицируется в клетки вместе с потерей функции NPH GFP из-за конкурентного ингибирования, на что указывает снижение секреции nph. GFP оценивается с помощью флуориметрии для выявления клеточных факторов, которые взаимодействуют с областью модификации секреции или SMR nef.

Высадка осадков производится с использованием SMR дикого типа NPH в качестве приманки. Наконец, чтобы проверить, влияют ли эти взаимодействия на секрецию, антитела против идентифицированных партнеров по связыванию трансфицируются в клетки. Чтобы оценить, антагонизируют ли они секрецию мотива НФ, полученные результаты идентифицируют два функциональных апоптотических мотива в НЭФ и ингибиторный пептид, который антагонизирует функциональный мотив секреции НЭФ, а также его клеточных партнеров по связыванию, необходимых для секреции.

Общая цель этой серии из четырех экспериментов состоит в том, чтобы ускорить идентификацию функциональных мотивов в белках-мишенях и затем использовать эти данные для разработки ингибиторов пептидных оснований этих функциональных мотивов. Этот набор протоколов был полезен для нашей группы, помогая нам ответить на ключевые вопросы, связанные с патогенезом ВИЧ, такие как понимание роли секреции, вызванной нефом, в патогенезе и в расшифровке механизмов, лежащих в основе способности неффа манипулировать экзосомальным путем транспортировки. Сегодня процедуры будет демонстрировать доктор Мин Бо Хуанг, который является инструктором-исследователем в моей лаборатории.

Начните эту процедуру с набора пептидов, сканирующих интересующую область для данного эксперимента. 20 пептидов mer с перекрытием 10 аминокислот, охватывающих весь белок ВИЧ, один NPH, были получены в рамках программы реагентов СПИДа. Чтобы определить мотивы апоптоза НПХ, проведите анализ апоптоза с использованием сканирующих пептидов NEF по отдельности следующим образом, добавьте один миллилитр питательной среды, содержащей 10 нанограмм на миллилитр пептида, на 35-миллиметровую пластину вяленой шляпы, клеточные культуры и инкубируйте культуры в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.

После инкубации проводят терминальный дезоксинуклеотидтрансферазу, опосредованный DUTP, биотинный ник и мечение или туннельный анализ для оценки апоптоза. Для этого сначала промойте клетки PBS, затем аспирируйте PBS и добавьте 4% альдегид параформы в PBS, инкубируйте 30 минут при комнатной температуре для фиксации клеток после фиксации клеток, промойте их PBS и добавьте Triton X 100, инкубируйте 10 минут при комнатной температуре, чтобы они проникли. После фиксации и проницаемости клеток добавьте туннельный реагент и инкубируйте клетки в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия после прохождения проницаемости.

Дважды промойте клетки PBS. Затем определите процент окрашенных клеток с помощью эпифлуоресценции на компьютерной микроскопической системе. После секции клеток jca с NPH, GFP плазмидой и различными вариациями пептида SMR с использованием набора реагентов для доставки белка Chariot, как описано в сопроводительном документе, соберите среду для определения эффективности трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.

Делайте флуоресцентные и светлопольные изображения и определяйте процент клеток. Затем трансфицируют для оценки ингибирования секреции NPH GFP, переносят 100 микролитров бесклеточной кондиционированной среды в отдельные лунки 96-луночного черного микротитрового планшета. Используйте флуориметр с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 515 нм для измерения флуоресценции GFP в среде в относительных единицах флуоресценции.

После завершения чтения перенесите данные на компьютер. Установите уровень флуоресценции GFP в контрольной среде на уровне 100%, затем сравните его с уровнем флуоресценции GFP в среде из клеток, совместно трансфицированных различными пептидами SMR, чтобы определить изменения в секреции NPH GFP. Со-ИС для выделения партнеров по связыванию мотивов является сложным шагом.

Убедитесь, что бусины правильно перемешиваются во время инкубации и что на каждом этапе промывки из бусин удаляется как можно больше жидкости. Выращивайте клетки в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS при 37 градусах Цельсия, в колбах для клеток с тканевой культурой T 75 путем центрифугирования при 1000-кратном перегрузке в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре PBS и переложите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Вращайте со скоростью 1000 G в течение одной минуты. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре лизиса Anti-Flag. Буферизация путем щадящего пипетирования дифференциально микроцентрифуги.

Суспензия при 2000 умноженных на G на 5 минут и на 13 000 G на 10 минут. Для гранулирования клеточных остатков и ДНК соответственно собирают надосадочную жидкость, далее именуемую лизатом. После определения концентрации белка добавьте один миллиграмм белка лизата и один микрограмм либо SMR дикого типа, либо мутантного пептида SMR к 20 микролитрам двухаффинного геля Anti-Flag M.

Этот аффинный гель далее обозначается смолой, доводящей смесь до конечного объема в один миллилитр в буфере co IP. Также готовят отрицательный контроль, при котором лизат соединяется со смолой в отсутствие любого из пептидов. Инкубируйте смеси при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи с переворачиванием из конца в конец.

На следующий день гранулируйте смолу методом микроцентрифугирования при температуре от 5 000 до 8 000 раз G в течение 30 секунд. После отжима подождите одну-две минуты, прежде чем брать образцы в руки, чтобы смола осядла в пробирке. Удалите надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки с узким концом или шприца Hamilton, стараясь не допустить попадания смолы.

Промойте смолу четыре раза, суспензив ее в 500 микролитрах буфера для промывки, с последующим микроцентрифугированием. Для элюирования связанных клеточных белков. Добавьте в пробирку 15 микрограммов избыточного пептида трех x Flag в 50 микролитрах промывочного буфера и инкубируйте на коромысле в течение 30 минут при комнатной температуре после инкубационной центрифуги при температуре от 5 000 до 8 000 раз G в течение 30 секунд.

Дав трубкам отстояться в течение двух минут, соберите и сохраните надосадочную жидкость, содержащую ускользающие белки. После концентрирования ЭИТ путем осаждения ацетона пробы кипятят в буфере для образцов laly. Затем разделите белки по странице SDS на 40-20% трисс, критерий HCL сборный гель окрасьте гель кумаси бриллиантовым синим R два 50.

Для оценки ингибирования антител cot cot transfect клеток JCA с NGFP и либо антифа-тубулином, либо антителом против смертности с использованием набора реагентов для доставки белка Chariot, как описано в сопроводительном документе, соберите бесклеточную кондиционированную среду из собранных клеток. Перелейте 100 микролитров в отдельные лунки 96 луночного черного микротитрового планшета. Затем измерьте флуоресценцию GFP в среде с помощью флуориметра с длиной волны возбуждения 485 нм и длиной волны излучения 515 нм в относительных флуоресцентных единицах.

После прочтения планшета перенесите данные на ПК и установите уровень флуоресценции GFP в контроле тубулина против жира на уровне 100%Сравните это с уровнем флуоресценции GFP в среде из клеток, трансфицированных антителами против смертности, чтобы определить изменения секреции NEF GFP для картирования апоптотических мотивов ВИЧ был проведен анализ сканирования пептидов белков NPH, как описано в этом видео. Ось Y показывает процент клеток, помеченных туннелем, а ось x обозначает условия лечения. Как показано здесь, были идентифицированы две отдельные области ВИЧ и один NEF, которые вызывают апоптоз. На это указывает повышенное туннельное мечение клеток, подвергшихся воздействию пептидов неф.

Пики апоптоза обозначены мотивом один и мотив два для оценки конкурентного ингибирования секреции нефа пептидами дикого типа SMR, культуральной средой из дерзких клеток CAT T, пересеченных клоном NPH GFP, и различными пептидами SMR проводили анализ секреции экзоомального NPH, как показано флуоресценцией GFP в среде: пептиды, содержащие один или несколько мотивов последовательности NPH дикого типа, ингибировали секрецию экзоомального NEF. В то время как замена аланина любой аминокислоты в этой области значительно снижает эффективность пептидов. Это говорит о том, что пептид дикого типа SM R ингибирует exo omal nph, 11-аминокислотную версию апоптотического мотива неффа. Один SM, ранее описанный и полученный от Sigma Genesis, использовался в качестве отрицательного контроля и не оказывал влияния на секрецию экзоомального NEP.

На этом изображении окрашенного геля SDS кумаси показано совместное иммунопреципитирование четырех белков пептидом дикого типа SMR с размерами 60, 65, 75 и 250 килодальтон. Мутантный пептид SMR с отрицательным контролем не захватывал эти белки, и эти белки не взаимодействовали неспецифически со смолой аффинности. В отсутствие пептида дикого типа SMR эти результаты позволяют предположить, что осажденные белки coun специфически взаимодействовали с мотивами SMR пептида дикого типа SMR.

Анализ с помощью планшета показывает, что трансфекция антисмертного антитела с экспрессией neph плазмиды полностью прекращает секрецию экзоомального NPH. Неродственное антитело не влияло на секрецию экзоомала. Эти результаты свидетельствуют о том, что для секреции экзоомального нефа требуется интактное взаимодействие талантов NM.

В заключение, после просмотра этого видео вы должны были хорошо понять, как использовать описанные методы для идентификации функциональных мотивов в целевых белках и использовать эти данные для разработки пептидных ингибиторов оснований этих функциональных мотивов. При выполнении процедуры co IP важно помнить о необходимости уделять особое внимание выполнению инкубационных промывок, следя за тем, чтобы шарики правильно перемешивались во время инкубации и чтобы как можно больше жидкости удалялось из бусин на каждом этапе промывки. Кроме того, во время промывки клеточной и лизатной смолы всегда позволяют смоле осесть после центрифугирования.

Используйте наконечники для пипеток с узким концом и сделайте четыре промывки, чтобы адекватно уменьшить фон до приемлемого уровня.