Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки
20 июня 2014 г.
Пептидные третичные амиды (ПТС) представляют собой надсемейство пептидомиметиков, которые включают, но не ограничиваются ими пептидами, пептоиды и N-метилированных пептидов. Здесь мы опишем синтетический метод, который сочетает в себе как сплит-и-бассейн и стратегии суб-мономера для синтеза одной шарик один-соединение библиотеку ПТС.
Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как синтезировать комбинаторные библиотеки, содержащие пептидные третичные единицы или единицы ТФК. Это достигается путем предварительного получения субмономера ЧФК из природных аминокислот. Второй шаг заключается в синтезе области пептидного линкера на твердой основе.
Далее синтезируется комбинаторная библиотека, содержащая ФТА и пептидные субъединицы. Заключительным этапом является определение характеристик синтезированной библиотеки для обеспечения качества синтеза. В конечном счете, синтезируется комбинаторная библиотека, содержащая подтверждающие ограниченные субъединицы ЧФК, и такая библиотека может быть использована для высокопроизводительного скрининга, чтобы получить белковые лиганды и привести к открытию новых лекарств.
Таким образом, химия, о которой идет речь в этой статье, была разработана в попытке найти молекулы, которые были бы намного жестче, чем некоторые пептиды и другие вещества, с которыми мы работали ранее. Идея заключается в том, что если идентифицировать библиотеки более жестких молекул, то они будут связываться с белковыми мишенями с гораздо более высоким сродством, и мы подумали, что это очень, очень важно при попытке разработать лекарства или даже интересные молекулы-зонды. Визуальная демонстрация этого синтеза подотряда PTA действительно имеет решающее значение, поскольку синтез трудно освоить, потому что температура и контроль времени действительно имеют решающее значение для успешного синтеза.
Сначала добавьте 8,9 грамма обеда и 11,9 грамма бромида калия в 500-миллилитровую колбу с круглым дном с тремя горлышками и магнитной мешалкой. Затем добавьте в колбу 100 миллилитров ранее приготовленного 30%-ного раствора бромистого водорода. После помещения колбы в отрицательные 10 градусов Цельсия этиленгликоль, сухой лед в ванне с пузырьками аргона через длинную иглу со дна колбы в течение 10 минут.
Перемешивает раствор с помощью магнитной мешалки при 300 об/мин. Вслед за этим добавьте заранее приготовленный раствор нитрита натрия в выравнивающую давление капельную воронку, прикрепленную к трем горлышкам, круглое дно колбы и заклейте ее перегородкой. Медленно откройте клапан капельной воронки, позволяя раствору нитрита натрия капнуть в колбу.
Управляйте клапаном, чтобы отрегулировать скорость капания примерно до двух капель в секунду. После того, как добавление нитрита натрия будет завершено, продолжайте помешивать раствор еще три часа, позволяя температуре прогреться с минус 10 градусов Цельсия до комнатной температуры. Если цвет раствора слишком темный, примените вакуум, чтобы удалить избыток оксидов азота и возможного брома, образующегося в ходе реакции.
После того, как раствор будет перенесен в экстракционную воронку, извлеките продукт три раза с 35 миллилитрами эфира датила. Соединив органическую фазу и промывку насыщенным рассолом, соберите его в колбу и просушите над сульфатом натрия в течение шести часов. После фильтрации сульфата натрия выпарите растворитель под вакуумом до получения прозрачного или бледно-желтого масла.
Очистите сырой продукт методом силикагелевой колонной хроматографии с тремя к одному гексана этилацетата для изотопного мечения, растворите 300 мг L аланина с 10 миллилитрами дейтерированной воды в 50-миллилитровой полиэтиленовой пробирке. Добавив 10 миллиграмм альфа-кетоглутарата в качестве подложки, пробирку прогрейте до 37 градусов по Цельсию. Когда закончите, отрегулируйте pH до 8,5–8,7 с помощью одномолярного раствора оксида натрия и тест-полосок pH.
Далее добавьте в раствор 0,1 миллиграмм аланинтрансаминазы. Поместите пробирку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение ночи с легким встряхиванием при 10–30 оборотах в минуту. В этот момент набухают один грамм 90 мкм, 10 до гелевых шариков с линкером Ram в 10 миллилитров диметилформамида в течение трех часов в 12-миллилитровом шприц-реакторе с легким встряхиванием, сливают диметилформамид из реактора и добавляют 10 миллилитров 20%-ного раствора перина диметилформамида, чтобы дезащитить группу FOC от катка среди линкера.
Встряхнув бусины с 20% раствором Пеппердина в течение 30 минут, промойте их пять раз с диметилформой мяса, чтобы удалить весь Пеппердин. Далее извлеките из шприца несколько бусин и проверьте их хлоральным тестом. Добавьте в бусины два миллилитра двухмолярного раствора бромоуксусной кислоты диметилформамида и осторожно встряхните.
Затем добавьте в бусины два миллилитра двухмолярного диопа раствора пропилкарбодиамина диметилформамида. Запаивая шприц поршнем, встряхните шарики на шейкере в течение 10 минут. После того, как бусины были тщательно промыты диметилформамидом, добавьте к ним два миллилитра заранее приготовленного раствора метоксиэтилметиламида с одним моляром.
Встряхнув бусины и промыв их пять раз диметилформамидом, проверьте несколько бусин с помощью хлорального теста. После этого добавьте в ранее использованный шприц 10 миллилитров раствора дихлорала метана диметилформамида один к одному. Равномерно разделите все шарики весом в один грамм на три пятимиллилитровых реактора шприца с помощью пипетки объемом 1000 микролитров с усеченным наконечником пипетки.
После трехкратной промывки трех шприцев метаном хлорметана трижды промыть шприцы с маркировкой R и S безводным тет гидрофурином, а меченый шприц В три раза - диметилформамидом. Для соединения тристина с бромпропаном NOIC кислотой добавьте примерно 200 мг тристина во флакон в вытяжном шкафу. После того, как флакон будет закрыт, взвесьте количество тристина, содержащегося во флаконе.
Затем добавьте в флакон соответствующее количество безводного тетра гидро феррана, чтобы получилось 20 миллиграмм на миллилитр раствора трифосгена тетра гидроферрана. Для приготовления смеси бромкислот трифосгена добавьте 89 микролитров R two Bromo propan NOIC acid и S two Bromo propan NOIC acid четыре в два небольших флакона отдельно в каждый флакон, добавьте по пять миллилитров раствора тристина tetra hydro furan. После запечатывания флаконов поместите их в морозильную камеру при температуре отрицательные 20 градусов Цельсия на 20 минут.
Тем временем добавьте 1 125 микролитров раствора тетрагидрофурана ди изопропиламина два к одному в шприц r и s. Отдельно добавьте 356 микролитров 2 4 6 триметилпурина в каждый из флаконов, содержащих охлажденные бром-кислоты и фосгеновые смеси, дающие белые осадки. Сразу же нанесите соответствующую суспензию непосредственно на ифицированные бусины, а затем поместите их на шейкер для встряхивания при 120 оборотах в минуту в течение двух часов.
Для соединения бромоуксусной кислоты с диизопропилкарбодиамином добавьте пять миллилитров двухмолярного раствора бромоилуксусной кислоты диметилформамида в шприц В. После встряхивания добавьте пять миллилитров двухмолярного раствора дипропилкарбодиамина диметилформамида в тот же шприц и аккуратно встряхните после этого место шприц Б на том же шейкере, что и шприц р и с. Затем встряхивайте шприцы в течение двух часов, предварительно тщательно промыв шприцы дихлорметаном и диметилформамидом. Соберите все шарики из шприцев R, S и B в один 12-миллилитровый шприц-реактор.
После того, как шарики были промыты пять раз диметилформамидом, добавьте в шприц 10 миллилитров раствора дихлорметана диметилформамида один к одному. Разделите все шарики поровну на семь отдельных двухмиллилитровых шприцев с помощью пипетки объемом 1000 микролитров с усеченным наконечником пипетки для эманации, добавьте в соответствующий шприц пять миллилитров из семи заранее приготовленных двух молярных растворов амина. Инкубируйте все семь шприцев в инкубаторе с температурой 60 градусов Цельсия с встряхиванием в течение ночи после инкубации.
Вымойте бусины, которые нужно расщепить пять раз, дихлоралметаном. Встряхнув бусины в течение 15 минут и снова промыв их дихлорметаном, слейте дихлорметан из шприца. Затем переложите каждую отдельную бусину в 96-луночную пластину.
С помощью светового микроскопа и пипетки с усеченным наконечником накройте пластину 96 лунки крышкой и поместите ее в морозильную камеру с отрицательными температурами 20 градусов Цельсия на 15 минут. После того, как тарелка будет извлечена из морозильной камеры, добавьте 20 микролитров заранее приготовленного охлажденного раствора хлорметана TFA DI один к одному в каждую лунку, содержащую шарик. Установите на место крышку и поместите настенную пластину 96 на шейкер обратно в морозильную камеру с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия.
Встряхнув в течение 20 минут, достаньте настенную пластину 96 из морозильной камеры и снимите крышку. Высушите феном дихлорметан из каждой лунки, обдувая его воздухом. При расщеплении при комнатной температуре с использованием 50% раствора ТФА DI хлорметана наблюдается значительная деградация.
Пики 593 и 484 соответствуют линкеру и тримеру ФТА соответственно, показывая, что вся молекула была успешно синтезирована на грануле, но деградировала во время расщепления. При расщеплении в условиях низких температур, как описано выше, количество деградации, вызванной ТЖК, значительно подавляется. Механизм расщепления был описан в предыдущей литературе, и считается, что он проходит через олайновый промежуточный продукт молекул ТФК может быть секвенирован Ms.MS, а картина фрагментации аналогична пептидам и пептидам.
Молекулы ЧФК, синтезированные с S-2, бромпропольной кислотой, D-4, обычно дают более широкие пики в МС и МСМ. Ms.Spectra из-за наличия продуктов неполного срока действия, таких как S два бромпропана, NOIC кислота D три, это может быть использовано в качестве указания на присутствие R хирального центра во время процедуры секвенирования, молекулы ТФК также имеют тенденцию образовывать больше аддукта, чем пептидный пептид. Поэтому предпочтение отдается воде с низким содержанием натрия и пластиковым аппаратам.
Еще одним потенциальным побочным продуктом является акриламид, образующийся в результате выведения брома во время аминирования. Как только акриламид образуется, последовательность прерывается. Эту проблему можно решить, снизив концентрацию первичного амина до одного моляра с целью уменьшения раствора.
Базичность После освоения библиотеки хорошего размера, ее можно подготовить за два дня, если все сделано правильно. Теперь, когда эта химия полностью разработана и синтез достаточно эффективен, я надеюсь, что другие исследователи возьмут на вооружение эту мощную технологию для создания конформационно ограниченных пептидных миметиков для разработки лекарств и зондов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта статья описывает синтетический метод создания пептидных третичных амидов (PTA), класс пептидомиметиков. Метод сочетает стратегии разделения и объединения и подмономерных стратегий для создания библиотеки PTA на одной бисерине.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Синтез пептидов
- Комбинаторная химия
- Открытие лекарств
Предыстория
- Пептидные третичные амиды являются разнообразной суперсемейством соединений.
- Они включают пептиды, пептоиды и N-метилированные пептиды.
- Комбинаторные библиотеки ценны для высокопроизводительного скрининга.
- PTA могут предоставить новые белковые лиганды для открытия лекарств.
Цель исследования
- Синтезировать комбинаторные библиотеки, содержащие PTA-блоки.
- Использовать натуральные аминокислоты для создания субмономерных PTA.
- Обеспечить высокопроизводительный скрининг для открытия лекарств.
Используемые методы
- Подготовка субмономерных PTA из натуральных аминокислот.
- Синтез области пептидного звена на твердой подложке.
- Создание комбинаторной библиотеки с PTA и пептидными субъединицами.
- Характеристика синтезированной библиотеки для обеспечения качества.
Основные результаты
- Успешно синтезирована комбинаторная библиотека, содержащая конформационно ограниченные PTA-блоки.
- Библиотека может быть использована для высокопроизводительного скрининга.
- Потенциальные применения включают открытие новых белковых лигандов.
- Метод демонстрирует эффективные техники синтеза и характеристики.
Выводы
- Синтетический метод предоставляет надежный подход к созданию PTA-библиотек.
- Такие библиотеки важны для продвижения усилий по открытию лекарств.
- Эта работа вносит вклад в область пептидомиметиков и комбинаторной химии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Conformationally constrained peptide mimetics such as peptide tertiary amides (PTAs) address a key challenge in early drug discovery: identifying high-affinity protein ligands from combinatorial libraries. By introducing steric and stereochemical constraints through side chains on both α-carbon and backbone nitrogen, PTAs enhance structural preorganization, improving the likelihood of target engagement. This approach supports mechanistic de-risking in lead generation by expanding chemical space beyond traditional peptides and peptoids, offering improved predictive confidence in ligand discovery campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through structurally constrained peptidomimetics that reduce conformational entropy upon binding.
- Operational Value: Supports biological de-risking by generating ligands with increased proteolytic stability and cell permeability, as demonstrated in prior peptoid studies.
- Predictive Value: Enhances target validation confidence by increasing the probability of identifying high-affinity binders from screened libraries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces one-bead one-compound (OBOC) libraries suitable for high-throughput screening against protein targets.
- Reproducibility: Employs split-and-pool synthesis with sub-monomer chemistry to ensure uniform bead-based compound presentation.
- Scalability: Enables generation of diverse PTA-peptide chimeric libraries amenable to automation and parallel synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a pathway from discovery-stage ligand identification to preclinical validation using MS/MS-sequenceable PTA scaffolds.
- Mechanistic De-risking: Reduces attrition risk by delivering ligands with defined conformation and reduced flexibility, improving target specificity predictions.
- Biomarker Alignment: Supports screening campaigns where conformational constraint correlates with functional activity in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling the synthesis of conformationally diverse PTA libraries that bridge peptidomimetic design and functional screening, supporting progression from target validation to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening by generating ligands with restricted conformation, improving hit-to-lead progression potential.
- Screening: Delivers OBOC libraries compatible with bead-based assays, enabling standardized, quantitative readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables library characterization via MS/MS sequencing, with fragmentation patterns comparable to peptides, supporting identity confirmation and purity assessment.
- Translational Research: Supports advancement to preclinical studies by yielding proteolysis-resistant and cell-permeable scaffolds suitable for further optimization.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, platform-capable approach for generating diverse PTA libraries across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in ligand discovery by accessing chemically diverse, conformationally constrained peptidomimetic space.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible synthesis of OBOC libraries using split-and-pool and sub-monomer strategies on solid support.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by increasing the likelihood of identifying high-affinity binders, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets through enhanced ligand quality and structural definition in early screening stages.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic synthesis, solid-phase chemistry, and sub-monomer techniques for PTA precursor preparation.
- Depends on anhydrous conditions, low-temperature reaction control, and inert atmosphere handling during key coupling steps.
- Necessitates access to microfluidic splitting tools, syringe reactors, and purification systems such as silica gel column chromatography.
- Involves optimization of cleavage conditions to minimize TFA-induced degradation, with low-temperature protocols recommended.
- Demands careful monitoring of side products such as acrylamide from amine overconcentration, which can terminate chain elongation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Acid Bromide from Natural Amino Acids and Isotopic Labeling of Alanine Using Transaminase
4:39
Synthesis of Peptoid Linker Region
6:15
Split-and-pool Synthesis of PTA Library with (R)- and (S)-2-bromopropionic Acids
11:10
Results: Characterization of a One-Bead-One-Compound Peptide Tertiary Amine Library
13:00
Conclusion
