Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ синтеза комбинаторных библиотек, содержащих третичные амиды пептидов или единицы PTA. Это достигается путем первоначального приготовления субмономера PTA из природных аминокислот. На втором этапе синтезируется область пептидного линкера на твердой подложке.

Затем синтезируется комбинаторная библиотека, содержащая субъединицы PTA и пептидов. Заключительным этапом является характеристика синтезированной библиотеки для подтверждения качества синтеза. В конечном итоге создается комбинаторная библиотека, содержащая конформационно ограниченные субъединицы PTA; такая библиотека может быть использована для высокопроизводительного скрининга с целью поиска белковых лигандов и разработки новых лекарственных препаратов.

Химические методы, ставшие предметом данной статьи, были разработаны в попытке найти молекулы, обладающие гораздо более высокой жесткостью, чем некоторые пептиды и другие соединения, с которыми мы работали ранее. Идея заключается в том, что поиск библиотек более жестких молекул позволит им связываться с белковыми мишенями с гораздо более высоким сродством; мы полагаем, что это крайне важно для дальнейшей разработки лекарственных препаратов или даже создания интересных молекул-зондов. Визуальная демонстрация синтеза PTA-субъединиц имеет решающее значение, поскольку этот процесс трудно освоить, так как соблюдение температурного режима и временных интервалов является критически важным для успешного синтеза.

Сначала добавьте 8,9 г диена и 11,9 г бромида калия в трехгорлую круглодонную колбу объемом 500 мл с магнитным перемешивающим элементом. Затем добавьте в колбу 100 мл предварительно приготовленного 30% раствора бромистоводородной кислоты. Поместив колбу в баню из этиленгликоля и сухого льда при температуре -10 °C, продувайте аргон через длинную иглу со дна колбы в течение 10 минут.

Перемешивали раствор с помощью магнитного перемешивателя со скоростью 300 RPM. После этого в уравнительную капельную воронку, присоединенную к трехгорлой круглодонной колбе, добавляли предварительно приготовленный раствор нитрита натрия и герметизировали ее септой. Медленно открывали кран капельной воронки, позволяя раствору нитрита натрия по каплям поступать в колбу.

Регулируйте клапан, чтобы установить скорость закапывания примерно на две капли в секунду. После завершения добавления нитрита натрия продолжайте перемешивание раствора еще в течение трех часов, позволяя температуре подняться от -10 °C до комнатной температуры. Если цвет раствора слишком темный, примените вакуум для удаления избытка оксидов азота и возможного брома, образовавшихся в ходе реакции.

После перенесения раствора в делительную воронку экстрагируйте продукт трижды 35 миллилитрами этилового эфира. Объедините органические фазы, промойте их насыщенным раствором NaCl, соберите в колбу и сушите над сульфатом натрия в течение шести часов. После фильтрования сульфата натрия выпарите растворитель под вакуумом до получения прозрачного или светло-желтого масла.

Очистите неочищенный продукт методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя смесь гексана и этилацетата в соотношении 3:1. Для изотопного мечения растворите 300 mg L-аланина в 10 mL дейтерированной воды в полиэтиленовой пробирке объемом 50 mL. После добавления 10 mg альфа-кетоглутарата в качестве косубстрата нагрейте пробирку до 37 °C. По завершении доведите pH до 8,5–8,7, используя 1 M раствор дейтерированного оксида натрия и pH-индикаторные полоски.

Затем добавьте в раствор 0,1 milligrams аланинаминотрансферазы. Поместите пробирку в инкубатор при 37 °C и инкубируйте в течение ночи при слабом перемешивании со скоростью 10–30 RPM. Одновременно с этим набухайте 1 gram гелевых бусин с Rink-линкером размером 90 micron в 10 milliliters диметилформамида в течение трех часов в реакторе-шприце объемом 12 milliliters при слабом перемешивании; затем слейте диметилформамид из реактора и добавьте 10 milliliters 20% раствора пиперидина в диметилформамиде для снятия защиты с Fmoc-группы Rink-амидного линкера.

После встряхивания гранул с 20% раствором пиперидина в течение 30 минут промойте их пять раз диметилформамидом, чтобы полностью удалить пиперидин. Затем извлеките несколько гранул из шприца и проведите хлоральный тест. Добавьте к гранулам два миллилитра 2 М раствора бромуксусной кислоты в диметилформамиде и осторожно встряхните.

Затем к гранулам добавьте два миллилитра 2 М раствора дициклогексилкарбодиимида в диметилформамиде. После герметизации шприца с помощью поршня перемешивайте гранулы на шейкере в течение 10 минут. После тщательной промывки гранул диметилформамидом добавьте к ним два миллилитра предварительно приготовленного 1 М раствора метоксиэтиламина в диметилформамиде.

После встряхивания гранул и их пятикратной промывки диметилформамидом проверьте несколько гранул с помощью хлорал-теста. Затем добавьте 10 milliliters раствора дихлорметана в диметилформамиде в соотношении один к одному в ранее использованный шприц. Распределите все один грамм гранул поровну между тремя шприц-реакторами объемом пять milliliters, используя 1000 microliter пипетку с укороченным наконечником.

После трехкратного промывания трех шприцев хлорметаном промойте шприцы с маркировкой r и s трехкратно безводным тетрагидрофураном, а шприц с маркировкой B — трехкратно диметилформамидом. Для конъюгации тризина с бромпропановой NOIC-кислотой добавьте примерно 200 мг тризина в виалу, работая в вытяжном шкафу. После закрытия виаллы крышкой взвесьте количество тризина в виале.

Затем добавьте в флакон соответствующее количество безводного тетрагидрофурана для получения раствора трифосгена в тетрагидрофуране с концентрацией 20 mg/mL. Для приготовления смеси бромокислот с трифосгеном добавьте по 89 µL R-2-бромпропановой кислоты и S-2-бромпропановой кислоты-d4 в два отдельных маленьких флакона; в каждый флакон добавьте 5 mL раствора трифосгена в тетрагидрофуране. После герметизации флаконов поместите их в морозильную камеру при температуре -20 °C на 20 минут.

Тем временем добавьте по 1,125 мкл раствора тетрагидрофурана и диизопропиламина в соотношении два к одному в шприцы R и S. Отдельно добавьте 356 мкл 2,4,6-триметилпурина в каждую из пробирок, содержащих охлажденные смеси бромкислоты и фосгена, что приведет к образованию белых осадков. Немедленно нанесите соответствующую суспензию непосредственно на модифицированные гранулы, затем поместите их на шейкер для перемешивания при 120 RPM в течение двух часов.

Для сопряжения бром-уксусной кислоты с диизопропилкарбодиимидом добавьте в шприц B пять миллилитров 2 M раствора бром-уксусной кислоты в диметилформамиде. После встряхивания добавьте в тот же шприц пять миллилитров 2 M раствора диизопропилкарбодиимида в диметилформамиде, осторожно перемешайте, после чего поместите шприц B на тот же шейкер, что и шприцы r и s. Затем встряхивайте шприцы в течение двух часов, после чего тщательно промойте их дихлорметаном и диметилформамидом. Перенесите все бусины из шприцев R, s и B в один реактор-шприц объемом 12 миллилитров.

После пятикратной промывки гранул диметилформамидом добавьте в шприц 10 milliliters раствора дихлорметана и диметилформамида в соотношении один к одному. Равномерно распределите все гранулы по семи отдельным шприцам объемом два milliliter, используя 1000 microliter пипетку с укороченным наконечником для облегчения высыпания; затем добавьте по пять milliliters из семи предварительно приготовленных двух молярных растворов амина в соответствующие шприцы. После инкубации выдержите все семь шприцев в инкубаторе при 60 degree Celsius в течение ночи при перемешивании.

Промойте бусины, предназначенные для расщепления, пять раз дихлорметаном. После встряхивания бусин в течение 15 минут и повторной промывки их дихлорметаном, удалите дихлорметан из шприца. Затем перенесите каждую отдельную бусину в 96-луночный планшет.

С помощью светового микроскопа и пипетки с усеченным кончиком накройте планшет на 96 лунок покровным стеклом и поместите его в морозильную камеру при температуре -20 °C на 15 минут. После извлечения планшета из морозильной камеры добавьте по 20 µL предварительно приготовленного охлажденного раствора TFA и дихлорметана в соотношении 1:1 в каждую лунку, содержащую бусину. Снова накройте планшет покровным стеклом и поместите его на шейкер обратно в морозильную камеру при температуре -20 °C.

После встряхивания в течение 20 минут извлеките 96-луночный планшет с высокими стенками из морозильной камеры и снимите защитную пленку. Удалите дихлорметан из каждой лунки, обдувая её потоком воздуха. При расщеплении при комнатной температуре с использованием 50%-го раствора TFA в дихлорметане наблюдается значительная деградация.

Пики 593 и 484 соответствуют линкеру и тримеру PTA соответственно, что указывает на успешный синтез всей молекулы на микросфере с последующей деградацией в процессе отщепления. При проведении отщепления в условиях низких температур, как описано выше, степень деградации, индуцированной TFA, значительно снижается. Механизм отщепления был описан в предыдущих публикациях; полагают, что он протекает через олефиновый интермедиат. Молекулы PTA могут быть секвенированы с помощью Ms.MS, при этом паттерн фрагментации аналогичен таковому для пептидов и пептидомиметиков.

Молекулы PTA, синтезированные с использованием S-2-бромпропионовой кислоты D-4, обычно дают более широкие пики в MS и msm. Спектры MS обусловлены присутствием продуктов неполного протекания реакции, таких как S-2-бромпропан, NOIC-кислота D-3; это может служить индикатором наличия R-хирального центра в процессе секвенирования. Молекулы PTA также склонны образовывать больше аддуктов с натрием, чем пептиды. Поэтому предпочтительно использовать воду с низким содержанием натрия и пластиковую посуду.

Другим потенциальным побочным продуктом является акриламид, образующийся в результате элиминирования брома в процессе аминирования. После образования акриламида последовательность обрывается. Эту проблему можно решить, снизив концентрацию первичного амина до 1 M для уменьшения пересыщения раствора.

При правильном подходе, после освоения методики, библиотека подходящего размера может быть подготовлена за два дня. Поскольку данный химический метод был полностью разработан, а синтез стал весьма эффективным, я надеюсь, что другие исследователи применят эту мощную технологию для создания конформационно ограниченных пептидных миметиков для разработки лекарственных препаратов и зондов.