Трехмерный конфокальный анализ микроглии/макрофагальных маркеров поляризации при экспериментальной травме головного мозга

Общая цель данного эксперимента — визуализировать экспрессию и клеточную локализацию маркеров фенотипа макрофагов микроглии после ишемии головного мозга. Во-первых, окрашиваются криоучастки ишемизированного мозга мышей для выявления маркеров активации макрофагов микроглии. Окрашенные срезы подвергаются трехмерной конфокальной визуализации.

Полученные изображения затем обрабатываются для создания трехмерной визуализации, а анализ изображений выполняется для локализации экспрессии маркеров в кластерах ячеек. Полученные данные демонстрируют эффективность трехмерного конфокального анализа в правильном назначении экспрессии маркеров конкретному клеточному телу Когда два маркера экспрессируются одной и той же клеткой, но в разных субклеточных компартментах, сама по себе колокализация может быть не очень информативной. Использование трехмерного анализа, как мы продемонстрируем здесь, позволяет получить лучшее разрешение и точность.

Хотя этот метод может дать представление о сложности реакции мозга на ишемическое повреждение, он также может быть применен к другим острым или хроническим состояниям, где была предложена двойная роль макрофагов микроглии в травме и восстановлении. Или в тех случаях, когда сигналы необходимо избирательно локализовать в разных специальных плоскостях, Карло Периго и Стефан из Магали проведут вас через различные этапы процедуры. В следующем протоколе используется ткань мозга мыши, ишемия которой была вызвана постоянной окклюзией средней мозговой артерии.

С помощью криостата собирают серийные 20-микронные корональные срезы мозга на желатин. Закрытые предметные стекла перед использованием доводят все реагенты и образцы до комнатной температуры. Обратите внимание, что рабочее разведение антител и сыворотки, перечисленных в сопроводительном документе, является результатом испытаний, проведенных с целью получения наилучшей эффективности при использовании различных антител и сыворотки.

Протокол должен быть проверен. Начните с обведения участков на предметном стекле с помощью блокирующей жидкости ручки, чтобы свести к минимуму количество необходимых реагентов. Затем поместите участки мозга во влажную камеру с помощью пипетки объемом в один миллилитр.

Добавьте в секции PBS комнатной температуры и выдержите пять минут, чтобы промыть их. Затем с помощью одноразового шприца объемом в один миллилитр с иглой удалите раствор и повторите промывку еще раз После снятия второй промывки приступайте к окрашиванию образцов с помощью пипетки объемом в один миллилитр и одноразового шприца для всех обменов раствора. Процедура окрашивания должна выполняться в обобщенном виде. Здесь.

Пожалуйста, ознакомьтесь с сопроводительным текстом для получения подробной информации, включая этапы стирки. Сначала клетки инкубируют с 1% перекисью водорода после блокировки обычной козьей сывороткой. Их инкубируют с первичными антителами против CD 11 B. Затем слайды инкубируют с подходящим вторичным антителом, за которым следует трисс, твин-буфер NACL или TNT, затем трисс, H-C-L-N-A-C-L, блокирующий буфер или TNB после инкубации с TNB.

Предметные стекла инкубируют со стрептавидином HRP с последующим усилением разбавителя, содержащего цианид пять тиром, который усиливает иммунофлуоресцентный сигнал. Затем предметные стекла инкубируют с NGS для блокирования неспецифических сайтов связывания. Затем их инкубируют с первичным антителом против CD 68.

После инкубации с первичным антителом клетки затем инкубируют в соответствующем фторконъюгированном вторичном антителе, за которым следует один микрограмм на миллилитр крючков для мечения ДНК. После завершения окрашивания монтируйте криосекции, используя пролонгированное золото при монтаже секций, избегайте образования пузырьков воздуха. Храните срезы при температуре четыре градуса Цельсия в темноте, пока они не будут проанализированы.

Регистрация флуоресцентного сигнала должна быть выполнена в течение одной недели. В этом протоколе используется микроскоп IX 81, оснащенный конфокальным сканирующим блоком FV 500 с тремя лазерными линиями: аргоном, криптоном на 488 нанометрах, гелием неоновым красным на 646 нанометрах и гелием неоновым зеленым на 532 нанометрах, а также УФ-диодом в программном обеспечении U 500. Выберите подходящие возбуждающие лазеры и дихроичные зеркала.

Также установите разрешение изображения минимум 800 на 600 пикселей. Далее поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и, используя эпифлуоресценцию, определите интересующую область, постепенно увеличивайте увеличение до 40-кратного объектива. Затем переключитесь на режим лазерной сканирующей микроскопии и запустите повторяющееся сканирование, регулируя уровень мощности фотоумножителя и усиление для каждого канала.

Это уменьшит перекрытие сигнала, вызванное современным возбуждением на разных длинах волн. Держите коэффициент усиления как можно ниже, чтобы избежать нежелательных неспецифических сигналов. Продолжая повторяющееся сканирование, отрегулируйте фокус и определите нижнюю и верхнюю крайние точки оси Z с общей длиной оси Z 10 мкм.

Затем остановите повторное сканирование. Затем введите размер шага. Он должен быть максимально приближен к размеру пикселя, который составляет 0,225 мкм.

Это даст стандартное соотношение размеров один к одному по оси Z в программном обеспечении Activate kalman filter не менее двух раз. Алгоритм Калмана представляет собой итерационную функцию, которая устраняет случайный сигнал, такой как одиночные положительные вокселы, принадлежащие фоновому шуму, тем самым улучшая соотношение сигнал/шум. Теперь активируйте режим последовательного сканирования, чтобы избежать эффектов просвечивания.

Переместитесь в середину оси Z и запустите последовательное сканирование по оси XY. Проверьте настройку ФЭУ и усиления, чтобы обеспечить удовлетворительное соотношение сигнал/шум. Запустите сбор данных XY, Z после сбора данных.

Экспортируйте данные в виде файла с несколькими файлами TIF. Каждый файл multi TIF обычно содержит три цветовых канала и 44 фокальные плоскости для обработки. Начните с открытия программного обеспечения imas.

Сначала выберите вид с превышением, затем загрузите файл multi TIF. Далее на панели настройки дисплея выберите нужный цвет для каждого здесь канала. Красный цвет представляет CD 11, B. Зеленый цвет представляет CD 68, а синий представляет собой пятно ДНК крючка для удаления шума с фона, увеличивая минимальное значение на панели настройки дисплея для каждого канала.

Затем перейдите к виду сечения, чтобы визуализировать одну фокальную плоскость XY с ортогональными проекциями осей x, Z и YZ. Переместитесь вдоль оси Z в поисках колокализации, которая отображается в виде желтых пикселей. Щелкните по желтой области, чтобы увидеть, присутствует ли колокализация вдоль оси Z, что указывает на ее принадлежность к оси Z твердотельного объекта.

Проекции видны в правой и нижней части рисунка. Сделайте снимок, затем вернитесь к виду. Затем в выпадающем меню редактирования выберите «Обрезать 3D» и обведите область интереса, чтобы изолировать клетку или кластер клеток.

Затем на панели настройки дисплея выберите один канал. Выберите построитель алгоритмов преодоления поверхностей. Затем, чтобы настроить алгоритм, сначала выберите канал.

Затем определите порог как минимальное значение, установленное на панели настройки дисплея, и при необходимости измените размер. Далее определим сглаживание как 0.200. Выберите цветовую панель и при необходимости измените внешний вид.

Повторите настройку для построителя алгоритмов преодоления поверхностей для каждого канала. Затем на панели настройки дисплея снимите флажок с флуоресцентных каналов и выберите все три поверхности. Наконец, переместите объем, чтобы найти наилучшее изображение, и сделайте снимок, чтобы определить закономерность коэкспрессии маркеров ММ.

Описанные в этом видео протоколы иммунофлюоресценции и конфокального сбора данных были выполнены на мышиной модели фокальной ишемии, вызванной постоянной окклюзией средней мозговой артерии. Двухмерный вид полученных изображений показывает, что через 24 часа после ишемии лизосомальные маркеры CD 68, показанные зеленым цветом, экспрессируются в гипертрофических среди CD 11 В-положительных клеток, которые красным цветом присутствуют в ишемическом ядре. Проекция по оси Z, показанная в правом нижнем углу, показывает, что распределение маркеров, задокументированное на виде в одной плоскости, также присутствует вдоль оси Z в пограничной зоне.

CD 11 B позитивные клетки демонстрируют гипертрофированные клеточные тела с процессами с высокой положительной для CD 68, что позволяет предположить, что фагосомы связаны с клеточной мембраной. Это указывает на активное кислотное поведение PHA клеток микроглии для оценки коэкспрессии CD 68 и YM one, маркера поляризации M two. Мм.Флуоресцентные изображения подверглись трехмерному рендерингу.

Трехмерное изображение полученных изображений, показанных здесь, указывает на наличие CD-68-положительных клеток, показанных зеленым цветом, и YM-1-положительных клеток, показанных красными флуоресцентными вокселями. При параллельном размещении наблюдатель может дать локализованный сигнал, видимый желтым цветом, который может быть не связан с фактическим расстоянием между маркерами. Чтобы определить колокализацию.

Одноплоскостной вид с проекциями оси Z должен быть сгенерирован при движении вдоль оси Z. Ищем колокализацию. Проекция по оси Z получается такой, как видно в правой и нижней части этого изображения.

Флуоресцентные воксели могут быть превращены в твердые объекты с помощью трехмерного рендеринга с присвоением экспрессии маркера конкретному клеточному телу. После большого увеличения и 3D-рендеринга два маркера кажутся принадлежащими разным ячейкам, которые находятся в непосредственной близости. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить иммунофлуоресцентный анализ с использованием нескольких маркеров и красителей, а также как правильно получать и визуализировать трехмерные изображения с помощью конфокальной микроскопии.

Кроме того, описанный анализ постобработки может быть плодотворно использован для анализа любой коэкспрессии или колокализации на клеточном уровне, или в тех случаях, когда сигналы необходимо выборочно локализовать в разных пространственных плоскостях.