Одновременное количественное определение клеточных и внеклеточных компонентов биопленок

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке и сравнении параллельных трехмерных распределений трех клеточных и внеклеточных компонентов биопленки после обработки антибактериальными агентами. Это достигается путем изготовления, а затем полировки композитных образцов из смолы. На втором этапе на образцах выращивают интересующие биопленки, а затем обрабатывают антибактериальными средствами.

Далее биопленки окрашиваются флуорохромами для внеклеточных полимерных веществ, нуклеиновых кислот и белков, а затем визуализируются с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. На заключительном этапе трехмерные изображения наложенных флуорохромов реконструируются для облегчения параллельной визуализации компонентов биопленки, а на основе изображений биопленки рассчитываются структурные параметры. В конечном счете, статистический анализ структурных параметров биопленки, таких как объем биопленки и средняя толщина биопленки, может быть выполнен для сравнения различий между группой лечения и контрольной группой.

Основное преимущество этой процедуры перед существующими методами заключается в том, что она использует отдельные, но взаимосвязанные методы для характеристики распределения нескольких компонентов в структуре биопленок, выращенных в определенных условиях, демонстрируя процедуру доктором Фернандо Флоресом, научным сотрудником, и мисс Кристен Смарт, научным сотрудником из моей лаборатории. Изготовлены формы из нержавеющей стали. Затем полимеризуйте первый прирост с помощью светодиодного светоотверждающего устройства в течение 40 секунд. Повторив процедуру для второго приращения, используйте полуавтоматическую шлифовальную машину для полировки отвержденных образцов до приемлемого конечного качества поверхности.

Наконец, простерилизуйте экземпляры, чтобы вырастить биопленку. Сначала инокулируют одну колонию S. mutans в четыре миллилитра ночной питательной среды, а затем инкубируют культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-18 часов для достижения оптической плотности не менее 0,9. Далее разведите культуру в соотношении один к 100 в 10 миллилитрах биопленочного роста.

Среду асептически переносят стерильную смолу составных образцов в стерильные 12 лунок, а затем добавляют по 2,5 миллилитров разведенной культуры в каждую из лунок. Для обработки полоскания рта и контрольных групп добавьте 2,5 миллилитра стерильной неинокулированной биопленки для роста среды, а затем вырастите биопленки при температуре 37 градусов Цельсия в микропарафилических условиях на шейкере при 100 оборотах в минуту. Через 24 часа асептически отсасывайте среду из всех лунок и дважды промойте каждую лунку 2,5 миллилитрами стерильного PBS, отсасывая физиологический раствор после каждого промывки, затем пополните каждую лунку 2,5 миллилитров свежей биопленочной питательной среды и инкубируйте планшет еще 24 часа, как только что было продемонстрировано для полного роста биопленки. Аспирируйте питательную среду, а затем выдайте по 2,5 миллилитра жидкости для полоскания рта в каждую лунку группы лечения и 2,5 миллилитра стерильной ультрачистой воды в контрольную группу.

Хорошо перемешайте пластины на орбитальном шейкере при 150 об/мин, а затем через 60 секунд отсасывайте жидкость для полоскания рта и сверхчистую воду из лунок, чтобы окрасить экзополисахаридный компонент биопленок. Инкубируйте каждую биопленку с 50 микролитрами конъюгата ЛОР в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Затем промывайте образцы два раза 2,5 миллилитрами буфера TC, аспирующего после каждой промывки, и окрашивайте нуклеиновые кислоты в каждой биопленке каплей Cyto Nine в объеме 50 микролитров в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.

После двукратной промывки образцов окрасьте белковые компоненты в каждой биопленке 50 микролитрами красного Ципро в течение 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света месте. После трехкратной промывки образцов перенесите их в отдельные лунки шестилуночной пластины, содержащей шесть миллилитров стерильной сверхчистой воды на лунку, чтобы облегчить их визуализацию с помощью конфокальной микроскопии для получения изображений каждого из составляющих окрашиваний в биопленках лечебной и контрольной групп. Установите лазеры конфокального лазерного сканирующего микроскопа на следующие настройки для детектирования экзополисахаридов с помощью конъюгированного окрашивания Exor, используйте лазер с яркостью 633 нм и полосу излучения от 659 до 749 нм для детектирования нуклеиновых кислот с помощью окрашивания Cyto Nine.

Используйте лазер с яркостью 488 нм и полосой излучения от 495 до 500 нм, а для обнаружения белков по красному окрашиванию Cipro используйте лазер с яркостью 543 нм и полосой излучения от 615 до 651 нм. Затем используется 63-кратный ближний объектив с числовой апертурой 0,9 и рабочим расстоянием 2,2 миллиметра. Собирайте изображения с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с частотой 400 Гц с помощью последовательного сканирования в режиме «между стеками» для оптимизации захвата изображений нескольких пятен в пределах одной биопленки.

После анализа изображений конфокальной лазерной сканирующей микроскопии используйте пункт меню 3D-рендерера в программном обеспечении для анализа скоростных изображений для создания реконструированного 3D-изображения наложенных на нее компонентов красителей внутри каждой биопленки. Далее поверните 3D-изображение, чтобы получить оптимальный вид биопленки. Затем сделайте снимок реконструкции биопленки и экспортируйте снимок в подходящий формат файла изображения.

Наконец, проведите визуальный анализ параллельного распределения нуклеиновой кислоты и белковых компонентов экзополисахарида в биопленках. На восстановленных изображениях рассчитаны структурные параметры биопленки, такие как объем биопленки и средняя толщина биопленки с помощью программного обеспечения ISA 3D, в этой таблице отображаются средние значения и значения стандартного отклонения структурных параметров биопленки, рассчитанные с помощью программного обеспечения для статистического анализа. Средние значения и значения стандартного отклонения для структурных параметров биопленок, обработанных жидкостью для полоскания рта, которые существенно отличались от таковых биопленок в контрольной группе, выделены красными смешанными моделями.

Статистический анализ показал, что ополаскиватель для полости рта Biotene PBF произвел структуры биопленки, которые значительно отличались от структуры контрольной группы на обоих композитах смол, в то время как ополаскиватель для полости рта Listerine total care не вызвал существенных различий ни на одном из композитов смол, что ясно указывает на различия в клеточных и внеклеточных компонентах биопленки, оставшихся после двух процедур полоскания рта. Одновременное распределение экзополисахаридов, нуклеиновых кислот и белков в биопленках может быть визуализировано с помощью 3D-реконструкций, созданных с помощью скоростного программного обеспечения. На этом рисунке показана репрезентативная реконструкция биопленок контрольной группы, выращенных на 0,4, синий цвет был присвоен экзополисахариду.

В биопленках S. mutans зеленый цвет был присвоен нуклеиновым кислотам, а красный — белкам. Промежуточное пространство может быть занято водой или другими компонентами биопленки, которые не были флуоресцентно мечены. На этом рисунке показана репрезентативная реконструкция биопленок контрольной группы, выращенных на композитах из трех смол TPH с цветами, представляющими те же компоненты, что и на предыдущем рисунке.

Эта процедура нашла применение в различных дисциплинах, таких как медицина, стоматология, геология и морские науки. Так как многие субстраты и биопленки можно заменить используемыми здесь.