Использование высокой пропускной

Общая цель данной процедуры заключается в создании композиционно репрезентативных многовидовых биопленок зубного налета. Для последующего параллельного анализа это достигается путем предварительного создания репрезентативной среды и инокулята. После инкубации инокулята в течение ночи он вводится в микрофлюидный чип, в результате чего внутри микроканала формируется биопленка.

Наконец, биопленку промывают и окрашивают для последующего исследования методом двухфотонной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопии in situ. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как использование проточных кювет, является высокая пропускная способность системы, позволяющая проводить несколько экспериментов параллельно при использовании меньшего количества материалов и отсутствии необходимости в искусственных лабораторных средах. Для начала соберите образцы слюны у группы из пяти или более добровольцев в отдельные пластиковые пробирки объемом 50 миллилитров.

Соберите образцы слюны в один пластиковый стакан, помещенный на лед. Избегайте использования стеклянных стаканов в данной схеме, так как биополимеры слюны имеют тенденцию прилипать к стеклянным поверхностям. Затем добавьте дитиотреитол в образец до достижения конечной концентрации 2.5 mM.

Перемешивайте смесь в течение 10 минут на льду. Перенесите всё содержимое в несколько пластиковых пробирок. Центрифугируйте образец на высокой скорости в течение 30 минут в охлажденной до 4 °C центрифуге, чтобы отделить твердые частицы от пробы.

Перенесите супернатант слюны в новый стерильный контейнер и удалите осадок, чтобы подготовить из образца среду для роста, свободную от бактерий. Сначала разбавьте образец, очищенный от клеточного дебриса, тремя объемами деионизированной воды. Затем профильтруйте его через мембранный фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0.22 µm.

Стерилизуйте слюну, поддерживая охлаждение фракции после фильтрации на льду. Отберите стерилизованный раствор и храните при температуре −80 °C до использования. Соберите образцы слюны у группы из пяти или более добровольцев в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 мл.

Перенесите образцы слюны в предварительно стерилизованный пластиковый стакан или пробирку объемом 50 мл, находящиеся при комнатной температуре. Добавьте стерильный глицерин до достижения соотношения 25% глицерина и 75% слюны.

В отличие от протокола приготовления питательной среды, где загрязнения удалялись путем фильтрации, в данном случае крайне важно соблюдать правила асептики, чтобы предотвратить контаминацию бактериями или грибками, не характерными для полости рта. Перемешайте раствор слюны с глицерином. Разнесите смесь слюны и глицерина по аликвотам и храните образцы при температуре -80 °C до начала работы.

Перед инокуляцией образцов в микрочип (как среды для негативного роста бактерий, так и инокулята с бактериями) при комнатной температуре на лабораторном столе приобретите или изготовьте микрофлюидный чип с микроканалом, аналогичным представленным здесь. Перед началом основного эксперимента перемешайте содержимое каждой пробирки с помощью вортекса в течение пяти секунд; начните с добавления 100 µL питательной среды в выходной резервуар микрочипа. Используя насос с компьютерным управлением, запустите сдвиговый поток среды через микроканал на две минуты.

При комнатной температуре визуально осмотрите каждый канал, чтобы убедиться в правильном заполнении жидкостью. Инкубируйте микрочип при комнатной температуре в течение 20 минут. Это позволит покрыть боковые стенки микроканалов биополимерным каркасом, к которому будет прикрепляться биопленка в процессе роста.

Затем вручную аспирируйте оставшуюся среду из выходного резервуара и перенесите эту фракцию, которая теперь будет выполнять функцию гидродинамического балансирующего груза, в входной резервуар. После осаждения биополимерного каркаса добавьте 100 µL положительного инокулята бактерий в выходной резервуар. Поместите микрочип на нагревательную плитку с температурой 37 °C и начните обратный поток среды со сдвигом.

Перемещайте жидкость из выходного резервуара во входной в течение ровно шести секунд. Затем выключите насос и инкубируйте чип в статических условиях при 37 °C в течение 40 минут, чтобы обеспечить прикрепление бактерий или грибов к боковым стенкам микроканала. Затем с помощью пипетки удалите и утилизируйте весь инокулят из выходного резервуара и снова заполните этот же резервуар, добавив 1 mL бесбактериальной ростовой среды.

Инкубируйте микрочип при 37 °C в течение примерно 20 часов при низком сдвиговом потоке для стимуляции роста биопленки внутри канала в течение ночи. Пипетируйте все растворы из входного и выходного резервуаров. Внесите 100 µL PBS во входной резервуар и промывайте микроканал в течение 20 минут.

При низком сдвиговом прямом потоке от входа к выходу биопленка готова к окрашиванию на живые и мертвые клетки. Непосредственно перед окрашиванием биопленки приготовьте по 100 µL смеси для окрашивания на жизнеспособность для каждого канала, который будет окрашиваться, согласно текстовому протоколу. Берегите этот раствор от воздействия света до момента окрашивания биопленки; аспирируйте всю оставшуюся жидкость из входного отверстия и заполните этот же резервуар 100 µL смеси для окрашивания на жизнеспособность.

Затем прокачивайте окрашивающий раствор через микроканал в течение 45 минут. При низком сдвиговом потоке при комнатной температуре обязательно защитите чип от воздействия света. Аспирируйте всю оставшуюся жидкость из входного резервуара и заполните его заново 100 µL PBS.

Промывайте микроканал в течение 20 минут при низком сдвиговом потоке при комнатной температуре, чтобы удалить избыток несвязавшихся красителей. Окрашенная биопленка готова к флуоресцентной микроскопии для анализа трехмерной архитектуры биопленок. Для просмотра общей структуры пленки под любым косым углом можно использовать цифровые реконструкции, полученные с помощью горизонтального сканирования на конфокальном микроскопе.

Кроме того, к тому же набору данных можно применить анализ окрашивания живых и мертвых клеток для изучения пространственной зависимости жизнеспособности клеток внутри биопленки в зависимости от различных способов химической обработки. После получения изображений биопленки можно выделить клетки из неокрашенных каналов. Затем, используя дистиллированную воду при высоком сдвиговом потоке, можно идентифицировать флору биопленки по геномной ДНК с помощью 4 5 4 пиросеквенирования.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, например, добавление различных видов микроорганизмов или соединений, чтобы ответить на иные вопросы, такие как реакция многовидовых биопленок при различных условиях.