Использование высокой пропускной In Vitro Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

Общей целью этой процедуры является создание композиционно репрезентативных, многовидовых биопленок зубного налета. Параллельно для анализа это достигается путем создания сначала репрезентативной среды и инокулята. Затем инокулюм вводится в микрофлюидный чип после ночной инкубации, внутри микроканала образуется биопленка.

Наконец, биопленку промывают и окрашивают для проведения in situ двух конфокальных лазерных сканирующих микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как проточные ячейки, заключается в том, что это система с высокой пропускной способностью, которая позволяет проводить несколько экспериментов параллельно, используя меньше материалов и не требуя искусственных лабораторных сред. Для начала соберите образцы слюны у когорты из пяти или более добровольцев в отдельные пластиковые пробирки объемом 50 миллилитров

Стяните образцы слюны в один пластиковый стакан, помещенный на лед. Избегайте использования стеклянных стаканов в этой системе, так как биополимеры слюны имеют тенденцию прилипать к стеклянным поверхностям. Далее добавьте в образец ди тио три отверстия до тех пор, пока его конечная концентрация не составит 2,5 миллимоля.

Перемешиваем смесь в течение 10 минут на льду. Стяните все содержимое в несколько пластиковых трубочек. Выполните высокоскоростной отжим в течение 30 минут в центрифуге с температурой 4 градуса Цельсия, чтобы отделить частицы от образца.

Переложите слюноотделение в свежий стерильный контейнер и выбросьте гранулированную фракцию, чтобы приготовить из образца питательную среду, свободную от бактерий. Во-первых, разбавьте дневную пробу без мусора тремя объемами деионизированной воды. Затем с помощью мембранного фильтра с низким содержанием белка 0,22 микро.

Стерилизуйте слюну, сохраняя постфильтрованную фракцию охлажденной на льду. Стерилизованный раствор произнесите и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не понадобится. Соберите образцы слюны у группы из пяти или более добровольцев в стерильных пластиковых пробирках объемом 50 миллилитров

Вытяните образцы слюны в предварительно простерилизованный пластиковый стакан комнатной температуры, или в пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте стерилизованный глицерин до 25% глицерина. Достигается 75% слюнной смеси.

В отличие от протокола с питательной средой, где загрязняющие вещества удалялись с помощью этапа фильтрации, здесь важна стерильная техника для предотвращения загрязнения специфическими бактериями или грибами, не входящими в ротовую полость. Смешайте раствор глицерина слюны. Хорошо аликвотируйте слюно-глицериновую смесь и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для начала.

Приобретите или изготовьте микрофлюидный чип с микроканалами, аналогичными показанным здесь, перед вводом образцов в микрочип как для отрицательной питательной среды, так и для бактериальной положительной инокуляции на стенде при комнатной температуре. Перемешайте каждую пробирку вихрем в течение пяти секунд, прежде чем приступить к основному эксперименту, начните с добавления 100 микролитров питательной среды в выпускной резервуар микрочипов. С помощью компьютерного управления насосом начинается поток среды по микроканалу в течение двух минут.

При комнатной температуре визуально осмотрите каждый канал, чтобы убедиться в правильном заполнении жидкостью. Инкубируйте микрочип при комнатной температуре в течение 20 минут. Таким образом, боковые стенки микроканала будут покрыты биополимерным каркасом, к которому биопленка будет крепиться во время роста.

Затем вручную отсасывают или оставшуюся среду из выпускного резервуара и передают эту фракцию, которая теперь будет выполнять роль гидродинамической уравновешивающей нагрузки, на входной резервуар. После осаждения биополимерного каркаса добавьте 100 микролитров бактериального положительного посева в выпускной резервуар. Поместите микрочип на нагревательную пластину с температурой 37 градусов Цельсия и запустите обратный поток при среднем сдвиге.

Путь от выходного до входного резервуара ровно шесть секунд. Затем выключите насос и инкубируйте чип в статических условиях при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут, чтобы облегчить прикрепление бактерий или грибков к боковым стенкам микроканала. Затем извлеките и выбросьте весь инокулюм из выпускного резервуара с помощью пипетки и снова наполните тот же резервуар, добавив один миллилитр питательной среды, свободной от бактерий.

Инкубируйте микрочип при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 20 часов при низком прозрачном потоке, чтобы стимулировать рост биопленки внутри канала после ночного роста. Пипетируйте все растворы как из входного, так и из выпускного резервуаров. Нанесите 100 микролитров PBS на входной резервуар и промойте микроканал в течение 20 минут.

При низком отвесном прямом потоке от входа к выходу биопленка теперь готова к окрашиванию живых мертвецов. Непосредственно перед окрашиванием биопленки приготовьте 100 микролитров смеси для окрашивания жизнеспособности, как указано в текстовом протоколе, для каждого окрашиваемого канала. Защищайте этот раствор от воздействия света до тех пор, пока он не понадобится для окрашивания биопленки, аспирируйте всю оставшуюся жидкость из входного отверстия и вновь наполните тот же резервуар 100 микролитрами окрашивающей смеси на жизнеспособность.

Затем протолкните раствор для окрашивания через микроканал в течение 45 минут. При низком объеме потока при комнатной температуре обязательно защищайте чип от воздействия света. Отасуньте всю оставшуюся жидкость из входного резервуара и снова наполните 100 микролитрами PBS.

Промойте микроканал в течение 20 минут при низкой доле потока при комнатной температуре, чтобы удалить излишки несвязанных красителей. Окрашенная биопленка теперь готова к флуоресцентной микроскопии для анализа трехмерной архитектуры биопленки. Цифровые реконструкции с использованием горизонтального сканирования с помощью конфокального микроскопа могут быть использованы для просмотра общей структуры пленки под любым косым углом.

Кроме того, анализ окрашивания живых мертвецов может быть применен к тому же набору данных для изучения пространственной зависимости жизнеспособности клеток внутри биопленки в зависимости от различных химических обработок. После того, как биопленка будет визуализирована, можно извлечь клетки из неокрашенных каналов. Используя дистиллированную воду, работающую с высоким сдвиговым потоком, биопленочная флора может быть затем идентифицирована по геномной ДНК с помощью 4 5 4 пиросеквенирования.

Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как добавление различных видов или соединений, могут быть применены для того, чтобы ответить на различные вопросы, например, что происходит с многовидовыми биопленками в различных условиях.