Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке различных субпопуляций специализированных клеток, которые дифференцируются в биопленках модельного организма, bacillus tintles. Это достигается путем предварительной вставки транскрипционных репортеров в хромосому B-тонкостей. Эти репортеры будут экспрессироваться исключительно в субпопуляции изучаемых клеток.

Следующим шагом является содействие развитию биопленки путем выращивания B-тонкостей в среде, индуцирующей биопленку, Ms GG gg. После образования биопленки клетки из биопленки диспергируются и фиксируются параформальдегидом. Заключительным этапом процедуры является обнаружение флуоресцентного сигнала, излучаемого отдельными клетками микробного сообщества, с помощью флуоресценции, микроскопии и проточной цитометрии.

В конечном счете, результаты показывают, как клетки специализировались на производстве и секреции. Внеклеточный матрикс, составляющий биопленку, представляет собой субпопуляцию, отличную от клеток, секретирующих сурфактант, сигнальную молекулу, ответственную за дифференцировку субпопуляции продуцентов матрикса. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как количественная оценка экспрессии транскрипции с использованием микролучевого анализа Vita Ities, заключается в том, что она позволяет нам контролировать экспрессию генов на уровне одной клетки и визуализировать особенно малые клеточные популяции клеток, специализированных для экспрессии конкретного гена.

Эти экспрессии генов не будут обнаружены при анализе общей популяции. Интегративные плазмиды используются для мечения B-тонкостей, и пример показан здесь. PTAA, промотор генов, отвечающих за выработку ТАСС.

Матричный белок клонируют в вектор с помощью сайтов рестрикции ECO R one и Hindi 3. Экспрессия репортерного гена CFP теперь находится под контролем ptap A, чтобы начать процедуру мечения B, тонко линеаризует интегративную плазмиду путем ферментативного переваривания. Рекомендуемым ферментом рестрикции является XH oh one, когда интегративная плазмида готова, индуцировать естественную компетентность в тончайшем штамме B 1 68 путем выращивания клеток в среде, индуцирующей компетентность, в течение пяти часов при 37 градусах Цельсия.

Добавьте линеаризованную плазмиду в культуру компетентных В-тончайших клеток и инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия через два часа, поместите клетки на агар с мицином и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Тонкая хромосома B имеет два нейтральных локуса, Amy, E, E и LAC A, которые могут быть использованы для интеграции репортерных слияний, не влияя на развитие биопленки. Линеаризованная плазмида PKM 0 0 8 интегрируется в геном B-тонкостей путем двойной рекомбинации.

Следующим шагом является перенос репортера с меченого штамма на штамм, способный образовывать биопленки по протоколу трансдукции одного фага SPP. В этом видео показаны только важные шаги протокола. Выращивают донорский штамм 168, поддерживая репортерное слияние в среде TY при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока культура не достигнет ранней стационарной фазы при соотношении от 200 микролитров клеток до 100 микролитров разведенного фагового запаса в стеклянной пробирке.

И давайте постоим при температуре 37 градусов по Цельсию на 15 минут. Далее пипеткой нанесите в пробирку горячий мягкий агар TY и тщательно перемешайте путем вортексирования. Аккуратно распределите на свежую пластину TY и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми-16 часов, чтобы дать возможность появиться фаговым ореолам.

Чтобы собрать фаговые ореолы, добавьте в пластину три миллилитра среды TY и с помощью стеклянной пипетки разбейте верхний агар. Переложите агаровую суспензию в соколиную трубку объемом 15 миллилитров. Осторожно взбейте агар, чтобы разбить агар, а затем центрифугируйте при 1000 G в течение 15 минут.

Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Пропустите надосадочную жидкость через точечный шприцевой фильтр 22 мкм. Используйте эту надосадочную жидкость для инфицирования культуры штамма-реципиента, выращенной в среде TY.

Добавьте 30 микролитров надосадочной жидкости к 10 миллилитрам разведенной культуры один к 10, и выдержите 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После этого центрифугируйте при 5000 об/мин в течение семи минут, суспензируйте гранулу в 200 микролитрах среды TY и распределите на планшете, содержащем мицин ОФЭКТ плюс 10 миллимоляров. Цитрат натрия.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12–36 часов. Выберите колонию и выращивайте ее в течение ночи в жидкой LB при температуре 37 градусов по Цельсию. Наконец, нанесите три микролитра ночной культуры на твердую среду, индуцирующую биопленку.

Дайте клеткам расти в течение 72 часов при температуре 30 градусов Цельсия. После трех дней роста биопленки, образующиеся на поверхности Ms.GG агара, разовьют сложную морфологическую архитектуру на поверхности агара. Чтобы начать эту процедуру, с помощью зубочистки или пинцета удалите биопленку с поверхности агара MSGG.

Консистенция биопленки должна позволять отслаивать ее от поверхности агара. Одним куском поместите биопленку в три миллилитра буфера PBS, разогнать биопленку по мягким температурам. Выполните 12 импульсов с выходом три и амплитудой 0,7 секунды для фиксации образцов перед анализом отдельных клеток.

Резус суспендируют 300 микролитров клеточной суспензии в одном миллилитре, 4%-ном растворе параформного альдегида, и инкубируют при комнатной температуре ровно семь минут. После семиминутной фиксации промойте клетки в PBS буфере три раза. Наконец, ресуспендируйте клетки в 300 микролитрах буфера PBS перед флуоресцентной микроскопией.

Приготовьте предметное стекло микроскопа, нанеся на предметное стекло 200 микролитров 0,8% агроса и тщательно накрыв его другим предметным стеклом. Через две минуты аккуратно снимите верхнюю горку, чтобы получить слой агроса, прикрепленный к горке на нижнем месте. Два микролитра неподвижных ячеек на поверхность агроса наносят слоем и накрывают ее с помощью микроскопа покровным стеклом.

Поместите образец на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Установите период возбуждения по отрицательному контролю, который не показывает флуоресценцию в выбранных для эксперимента условиях. Экспозиция должна составлять от 50 до 200 миллисекунд.

Получите флуоресцентное изображение, а также изображение яркого поля для каждого поля зрения. Чтобы подготовить клетки к анализу проточной цитометрии, диспергируйте образец неподвижных клеток с помощью мягкой ультразвука. Выполните две серии по 12 импульсов с выходом пять и амплитудой 0,7 секунды, чтобы рассеять скопления в отдельные клетки, не вызывая лизиса клеток.

Подтвердите эффективность клеточного диспергирования с помощью световой микроскопии. Далее разведите образец один к 100 в PBS буфере. Для этого анализа на флуоресценцию YFP будет использоваться двухпоточный цитометр BD.

Для флуоресценции CFP используется лазерное возбуждение на 488 нанометрах в сочетании с фильтром 5 30 30. Используется лазерное возбуждение на 405 нанометрах в сочетании с фильтром 4 0 8 40, калибровка проточного цитометра с двумя отрицательными регуляторами. Образец PBS-буфера без клеток в суспензии должен служить отрицательным контролем размера частицы, воспринимаемой проточным цитометром.

Проба без флуоресцентного репортера должна служить отрицательным контролем флуоресцентной чувствительности потока. Цитометр после калибровки помещает образец, помеченный флуоресцентным репортером, в проточный цитометр для каждого образца, анализирует не менее 50 000 событий со скоростью потока в пределах 303 000 событий в секунду. Когда B Subtles растет на пластине среды, индуцирующей биопленку, образование биопленки MSGG наблюдается после трех дней инкубации при 30 градусах Цельсия.

Биопленка демонстрирует сложную морфологическую архитектуру, которая указывает на различные участвующие в ней клеточные субпопуляции. Например, образование внеклеточного матрикса и биопленок приводит к образованию морщин на поверхности колонии. На этом рисунке показан пример визуализации дифференцировки клеток в одном меченом штамме с помощью флуоресцентной микроскопии.

Этот штамм содержит флуоресцентный репортер Ptap, CFP, который экспрессируется в субпопуляции клеток, продуцирующих матрикс, окрашенных в синий цвет. Эта субпопуляция производит и выделяет внеклеточный матрикс, из которого состоит биопленка. Следующее изображение является результатом визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии штамма с двойной меткой, который содержит репортер Ptap, A CFP и дополнительный репортер P Surfactin YFP.

Этот второй репортер позволяет осуществлять мониторинг субпопуляции клеток, ответственных за секрецию сигнальной молекулы сурфактина, которая запускает сигнальный каскад для дифференцировки продуцентов матрицы. Здесь продуценты матрицы окрашены в синий цвет, в то время как продуценты поверхностно-активных веществ окрашены в желтый цвет, что является результатом двумерной проточной цитометрии с использованием одного меченого штамма, в котором находится репортерный ptap. Здесь представлен YFB.

Необработанный контрольный штамм без генов флуоресцентных белков показал одну популяцию с клетками с низкой относительной флуоресценцией, содержащими ptap. YFP в условиях, не индуцирующих биопленку, не дифференцировал субпопуляцию продуцентов матрицы, и вся популяция также показала низкую относительную флуоресценцию. Напротив, в условиях, индуцирующих биопленку, субпопуляция клеток с высокой относительной флуоресценцией была обнаружена в виде плеча справа от низкой относительной флуоресценции.

Здесь представлены пиковые результаты, полученные с помощью 3D проточной цитометрии. Флуоресцентные сигналы контролируемых каналов представлены по оси X для YFP и по оси Y Для CFP на верхней левой панели показан штамм без генов флуоресцентного белка в качестве контроля фоновой флуоресценции. На правой верхней панели был использован один меченый штамм для обнаружения субпопуляции продуцентов сурфактина в флуоресцентном канале YFP, обрамленном желтым цветом.

На нижней левой панели для обнаружения субпопуляции матричных продуцентов был использован другой одиночный меченый штамм. В флуоресцентном канале CFP, выделенном в синий цвет, субпопуляции продуцентов матрицы и продуцентов поверхностно-активных веществ контролируются с помощью штамма с двойной меткой, и представляются результаты. На этой нижней правой панели.

Обнаружены две субпопуляции клеток, экспрессирующих высокие уровни флуоресцентных репортеров. Каждая популяция структурирована, показывая, что нет перекрытия в экспрессии репортеров между двумя субпопуляциями специализированных клеток. На этом последнем рисунке показана количественная оценка субпопуляций матричных продуцентов и каннибалов с помощью 3D-проточной цитометрии.

В верхней правой панели для обнаружения субпопуляции каннибалов использовался один меченый штамм. В флуоресцентном канале YFP, выделенном в желтый цвет, эта субпопуляция каннибалов была описана как дифференцированная с субпопуляцией производителей матрицы. На нижней левой панели субпопуляция продуцентов матрицы обнаружена в другом одиночном меченом штамме в флуоресцентном канале CFP.

Обрамленные синим цветом результаты исследования штамма с двойной меткой в нижней правой части показали одну субпопуляцию флуоресцентных клеток, экспрессирующих как YFP, так и CFP, обрамленных зеленым цветом. Одновременная экспрессия двух репортеров указывает на то, что оба пути дифференцировки клеток активируются координатами в одной и той же субпопуляции. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать и количественно оценить различные субпопуляции клеток, составляющие микробную биопленку, с помощью клеточного анализа клеточной популяции, такого как флуоресцентная микроскопия или проточная цитометрия.