Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации и количественной оценке отдельных субпопуляций специализированных клеток, которые дифференцируются в биопленках модельного организма Bacillus subtilis. Это достигается путем первоначального встраивания транскрипционных репортеров в хромосому B. subtilis. Эти репортеры будут экспрессироваться исключительно в изучаемой субпопуляции клеток.

Следующим этапом является стимуляция развития биопленки путем культивирования B subtles в среде для индукции биопленки Ms GG gg. После формирования биопленки клетки из нее диспергируют и фиксируют параформальдегидом. Заключительным этапом процедуры является детектирование флуоресцентного сигнала, излучаемого отдельными клетками микробного сообщества, с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

В конечном итоге результаты демонстрируют, как специализируются клетки для продукции и секреции. Клетки, формирующие внеклеточный матрикс биопленки, представляют собой отдельную субпопуляцию, отличную от клеток, секретирующих сурфактант — сигнальную молекулу, отвечающую за дифференцировку субпопуляции продуцентов матрикса. Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как количественное определение экспрессии транскриптов с помощью анализа жизнеспособности или микрочипового анализа, заключается в том, что он позволяет мониторировать экспрессию генов на уровне отдельных клеток и визуализировать особенно малые популяции клеток, специализирующихся на экспрессии конкретного гена.

Эти экспрессии генов не будут обнаружены при анализе общей популяции. Интеграционные плазмиды используются для маркировки B-субтильных элементов, пример чего показан здесь. PTAA — промотор генов, ответственных за выработку tass.

Матриксный белок клонируют в вектор с использованием сайтов рестрикции EcoRI и HindIII. Экспрессия репортерного гена CFP теперь находится под контролем ptapA. Чтобы начать процедуру маркировки B. subtilis, линеаризуйте интегративную плазмиду путем ферментативного расщепления. Рекомендуемым ферментом рестрикции является XhoI. Когда интегративная плазмида будет готова, индуцируйте естественную компетентность штамма 168 B. subtilis, культивируя клетки в среде для индуцирования компетентности в течение пяти часов при 37 °C.

Добавьте линеаризованную плазмиду в культуру компетентных клеток B. subtilis и инкубируйте в течение двух часов при 37 °C. По истечении двух часов высейте клетки на агар со спектномицином и инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Хромосома B. subtilis имеет два нейтральных локуса, AmyE и LAC A, которые могут быть использованы для интеграции репортерных слияний без влияния на развитие биопленки. Линеаризованная плазмида PKM 0 0 8 интегрируется в геном B. subtilis путем двойной рекомбинации.

Следующим шагом является перенос репортера из маркированного штамма в штамм, способный формировать биопленки, используя протокол трансдукции фагами SPP one. В данном видео показаны только основные этапы протокола. Вырастите донорский штамм 1 68, содержащий репортерный химерный белок, в среде TY при 37 °C до достижения культурой ранней стационарной фазы; затем смешайте 200 µL клеток с 100 µL разведенного стока фагов в стеклянной пробирке.

Выдержите смесь при температуре 37 °C в течение 15 минут. Затем пипетируйте горячий мягкий агар TY в пробирку и тщательно перемешайте с помощью вортекса. Осторожно распределите смесь по поверхности свежей чашки с агаром TY и инкубируйте при температуре 37 °C от 8 до 16 часов до появления фаговых гало.

Для сбора фаговых гало добавьте в чашку три миллилитра среды TY и с помощью стеклянной пипетки разбейте верхний слой агара. Перенесите суспензию агара в фальконовскую пробирку объемом 15 миллилитров. Осторожно перемешайте на вортексе для полного разрушения агара, затем центрифугируйте при 1000 G в течение 15 минут.

Перенесите супернатант в новую пробирку. Пропустите супернатант через шприцевой фильтр с порами 22 micron. Используйте этот супернатант для заражения культуры реципиентного штамма, выращенного в среде TY.

Добавьте 30 µL супернатанта к 10 mL культуры, разведенной в соотношении 1:10, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. После этого центрифугируйте при 5 000 об/мин в течение семи минут, ресуспендируйте осадок в 200 µL среды TY и высейте на чашку с SPECTmycin и 10 мM цитрата натрия.

Инкубируйте при 37 °C в течение от 12 до 36 часов. Выберите колонию и культивируйте ее в течение ночи в жидкой среде LB при 37 °C. Наконец, нанесите 3 µL ночной культуры капельно на твердую среду, индуцирующую образование биопленки.

Позвольте клеткам расти в течение 72 часов при 30 °C. После трех дней роста биопленки, образовавшиеся на поверхности агара Ms.GG, разовьют сложную морфологическую структуру на поверхности агара. Чтобы начать эту процедуру, используйте зубочистку или пинцет, чтобы удалить биопленку с поверхности агара MSGG.

Консистенция биопленки должна позволять отделять ее от поверхности агара. Перенесите биопленку целиком в 3 mL буфера PBS и аккуратно диспергируйте ее. Для подготовки образцов к анализу отдельных клеток выполните 12 импульсов при выходной мощности 3 и амплитуде 0,7 с.

Перевзвесьте 300 µL клеточной суспензии в 1 mL 4% раствора параформальдегида и инкубируйте при комнатной температуре ровно семь минут. После семиминутной фиксации трижды промойте клетки буфером PBS. В завершение перевзвесьте клетки в 300 µL буфера PBS перед проведением флуоресцентной микроскопии.

Подготовьте предметное стекло, пипеткой нанеся 200 µL 0.8% agros на стекло и аккуратно накрыв его другим стеклом. Через две минуты осторожно снимите верхнее стекло, чтобы получить слой agros, закрепившийся на нижней части предметного стекла. Нанесите 2 µL фиксированных клеток на поверхность слоя agros и накройте его покровным стеклом.

Поместите образец на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Установите время экспозиции, используя отрицательный контроль, который не проявляет флуоресценции в условиях, выбранных для эксперимента. Время экспозиции должно составлять от 50 до 200 миллисекунд.

Получите флуоресцентное, а также изображение в светлом поле для каждого поля зрения. Чтобы подготовить клетки для анализа методом проточной цитометрии, диспергируйте образец фиксированных клеток с помощью мягкой соникации. Выполните две серии по 12 импульсов с выходной мощностью 5 и амплитудой 0,7 seconds, чтобы разбить агрегаты на отдельные клетки, не вызывая лизиса клеток.

Подтвердите эффективность диспергирования клеток с помощью световой микроскопии. Затем разведите образец в 100 раз в PBS-буфере. Для анализа YFP-флуоресценции будет использован проточный цитометр BD FACSCanto II.

Для детекции флуоресценции CFP используется лазерное возбуждение на длине волны 488 нанометров в сочетании с фильтром 5 30 30. Используется лазерное возбуждение на длине волны 405 нанометров в сочетании с фильтром 4 0 8 40; откалибруйте проточный цитометр с помощью двух отрицательных контролей. В качестве отрицательного контроля размера частиц, регистрируемых проточным цитометром, следует использовать образец буфера PBS без клеток в суспензии.

Образец без флуоресцентного репортера должен служить отрицательным контролем для определения флуоресцентной чувствительности проточного цитометра. После калибровки поместите образец, меченный флуоресцентным репортером, в проточный цитометр; для каждого образца анализируйте не менее 50 000 событий при скорости потока от 303 000 событий в секунду. При росте B Subtles на чашке с биопленкоиндуцирующей средой MSGG формирование биопленки наблюдается через три дня инкубации при 30 °C.

Биопленка демонстрирует сложную морфологическую архитектуру, свидетельствующую о наличии различных участвующих субпопуляций клеток. Например, выработка внеклеточного матрикса и формирование биопленок приводят к появлению складок на поверхности колонии. На этом рисунке представлен пример визуализации дифференцировки клеток в одном меченом штамме с помощью флуоресцентной микроскопии.

Этот штамм содержит флуоресцентный репортер Ptap, A CFP, который экспрессируется в субпопуляции матрикс-продуцирующих клеток, окрашенных в синий цвет. Эта субпопуляция вырабатывает и секретирует внеклеточный матрикс, который составляет биопленку. Следующее изображение представляет собой результат визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии дважды меченого штамма, содержащего репортер Ptap, A CFP и дополнительный репортер P Surfactin YFP.

Этот второй репортер позволяет осуществлять мониторинг субпопуляции клеток, ответственных за секрецию сигнальной молекулы сурфактина, которая запускает сигнальный каскад дифференцировки продуцентов матрикса. Здесь продуценты матрикса окрашены в синий цвет, а продуценты сурфактина — в желтый; представлены результаты 2D-проточной цитометрии с использованием одного маркированного штамма, содержащего репортер ptap. Здесь представлена YFB.

Необработанный контрольный штамм без генов флуоресцентных белков продемонстрировал единую популяцию клеток с низкой относительной флуоресценцией, несущих ptap. YFP в условиях, не индуцирующих образование биопленок, не выявил субпопуляцию продуцентов матрикса, и вся популяция также характеризовалась низкой относительной флуоресценцией. Напротив, в условиях индуцирования биопленок была обнаружена субпопуляция клеток с высокой относительной флуоресценцией, проявившаяся в виде «плеча» справа от пика низкой относительной флуоресценции.

Здесь представлены результаты анализа пиков, полученные с помощью 3D-проточной цитометрии. Флуоресцентные сигналы контролируемых каналов представлены на оси X для YFP и на оси Y для CFP; на верхней левой панели показан штамм без генов флуоресцентных белков в качестве контроля фоновой флуоресценции. На верхней правой панели использован один меченый штамм для обнаружения субпопуляции продуцентов сурфактина в канале флуоресценции YFP, выделенном желтой рамкой.

На нижней левой панели для обнаружения субпопуляции продуцентов матрикса использовался другой одиночно маркированный штамм. На нижней правой панели представлены результаты мониторинга субпопуляций продуцентов матрикса и сурфактанта с помощью дважды маркированного штамма в канале флуоресценции CFP, обведенном синим цветом.

Обнаруживаются две субпопуляции клеток, экспрессирующих высокие уровни флуоресцентных репортеров. Каждая популяция обведена рамкой, что демонстрирует отсутствие перекрытия экспрессии репортеров между двумя субпопуляциями специализированных клеток. На этом финальном рисунке представлен количественный анализ субпопуляций продуцентов матрикса и «каннибалов», выполненный с помощью 3D-проточной цитометрии.

На верхней правой панели для обнаружения субпопуляции каннибалов использовался один маркированный штамм. В канале флуоресценции YFP, обведенном желтым цветом, эта субпопуляция каннибалов была описана как дифференцирующаяся согласованно с субпопуляцией продуцентов матрикса. На нижней левой панели субпопуляция продуцентов матрикса обнаружена в другом маркированном штамме в канале флуоресценции CFP.

Результаты для штамма с двойной меткой на панели в правом нижнем углу, обведенные синим цветом, показали одну субпопуляцию флуоресцентных клеток, экспрессирующих как YFP, так и CFP (обведены зеленым цветом). Одновременная экспрессия двух репортеров указывает на то, что оба пути дифференцировки клеток координированно активируются в одной и той же субпопуляции. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как визуализировать и количественно определять отдельные субпопуляции клеток, составляющих микробную биопленку, используя такие методы анализа клеточных популяций, как флуоресцентная микроскопия или проточная цитометрия.