Метод для культивирования эмбриональных С. Элеганс Клетки

Общей целью этой процедуры является диссоциация и культивирование in vitro, эмбрионов, морских элегантных клеток. Это достигается путем выращивания большого количества могильных животных. Далее яйца выделяют от взрослых особей.

Затем яйца обрабатывают хитиназой для растворения яичной скорлупы. Наконец, клетки вручную диссоциируются и покрываются для культивирования. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают экспрессию клеточных специфических маркеров с помощью иммунофлуоресценции, микроскопии, электрофизиологии и методов визуализации кальция.

Демонстрировать процедуру будет реля, постдокторская лаборатория. После культивирования не менее четырех пластин морской элегантности до взрослой стадии GR и приготовления сред и растворов согласно текстовому протоколу. Начните выделение яиц с предварительного протравливания пробирки с заранее приготовленным раствором арахисового лектинового бульона.

Поместите автоклавные крышки в лунки 24-луночной пластины и добавьте 200 микролитров арахисового лектина в каждую крышку, выдержите не менее одного часа при комнатной температуре. Далее отсасывайте раствор и с помощью стерильной воды промывайте лунки. После удаления всех следов лектина арахиса необходимо предотвратить слипание клеток.

Затем с помощью стерильной автоклавной воды смыть ГР взрослых особей с агаровых пластин и собрать суспензию в две стерильные конические пробирки по 50 миллилитров. Поместите пробирки на лед на срок до пяти минут, чтобы черви осядли на дно С помощью передаточной пипетки удалите воду и замените ее на свежую стерильную автоклавную центрифугу для воды. Червей по 200 г в течение 10 минут.

После окончательной промывки, подвешиваем червей в пресной стерильной воде и перекладываем их в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров перед повторным отжимом при 200 G в течение 10 минут. Если черви не полностью гранулированы, поместите трубку на лед на пять минут. Как только черви полностью осядут, удалите воду и добавьте пять-шесть миллилитров лизисного раствора.

Затем осторожно покачивайте суспензию в течение пяти-10 минут и каждые две-три минуты накапывайте каплю суспензии на защитный лист и проверяйте лизис под стереомикроскопом. Когда 72 80% червей лизируются, остановите реакцию лизиса, добавив девять миллилитров яйцевого буфера перед вращением, зажгите горелку Бунзена и держите ее включенной, чтобы предотвратить повторное загрязнение яиц, осторожно удалите надосадочную жидкость и используйте яйцевой буфер, чтобы тщательно промыть гранулу три-четыре раза, пока раствор не станет прозрачным. Далее, после удаления последней надосадочной жидкости отделить яйца от тушки животного, суспендировать гранулу в двух миллилитрах стерильного яичного буфера и добавить два миллилитра 60%-ной сахарозы в яичный буфер

Яйца хорошо перемешать в растворе перед центрифугированием в течение 20 минут. При 200 G осторожно извлеките пробирки из центрифуги. Яйца будут плавать в верхней части раствора.

Поэтому с помощью пипетки и стерильными одномиллилитровыми наконечниками переложите яйцеклетки в свежую стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров. Используйте стерильный буфер для яиц, чтобы промыть яйца три раза, работая под ламинарным вытяжным колпаком. Чтобы избежать внесения бактериального заражения, ревностизируйте, суспензируйте гранулированные яйца в одном миллилитре двух миллиграммов на миллилитр киназы и переложите их в свежую коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Покачивайте трубку от 10 до 30 минут при комнатной температуре, в зависимости от свежести фермента, когда примерно 80% яичной скорлупы будет переварено. Центрифугируйте яйца при 900 г в течение трех минут. Аккуратно удалив надосадочную жидкость, добавьте три миллилитра среды L 15, переложите яйца в пластину диаметром шесть сантиметров и начните ручную диссоциацию с помощью стерильного шприца объемом 10 миллилитров с иглой 18 калибра.

Чтобы следить за степенью диссоциации, поместите каплю суспензии в свежую чашку Петри и рассмотрите под микроскопом. Продолжайте до тех пор, пока не будет диссоциировано примерно 80% клеток. Чтобы удалить клеточные комки, непереваренные яйца и вылупившихся личинок, осторожно отфильтруйте суспензию через фильтр размером пять микрон и пропустите через фильтр еще четыре-пять миллилитров среды L 15, чтобы восстановить клетки и культивировать клетки.

После центрифугирования фильтрата при 900 G в течение трех минут, резус суспендирует клетки в полной среде L 15 по одному миллилитру на лунку и хранит планшеты во влажной герметичной камере при температуре 20 градусов Цельсия в окружающем воздухе. Для того чтобы дифференцировать изолированный эмбриональный элеган, клетки должны прилипнуть к субстрату. Процесс дифференцировки начинается примерно через два-три часа после нанесения покрытия и продолжается около 24 часов.

Морфологические особенности in vitro удивительно схожи с таковыми in vivo. Например, как показано здесь, у LM и PLM соприкасающихся нейронов развиваются только два нейронных процесса, один из которых длиннее другого, как это происходит in vivo. Это говорит о том, что, по крайней мере, некоторые молекулярные механизмы, которые управляют дифференцировкой в клетках элегана, являются автономными и, таким образом, могут быть воспроизведены.

Белковые маркеры in vitro и посттрансляционные модификации, специфичные для клеток, также могут наблюдаться in vitro. Например, альфа-тубулин представляет собой насыщенные только на контакт нейроны в морском элгане, как показано здесь in vitro процессы окрашивания контактных нейронов антителом, выращенным против насыщенного альфа-тубулина. Кроме того, как видно на этой панели, культивируемые сенсорные нейроны экспрессируют токсичный мутантный канал MEC four D, который действительно вызывает гибель сенсорных нейронов in vivo.

Нейроны, экспрессирующие GFP, полученные из штамма MEC four DPE 4G FP, первоначально присутствуют в культуре, но затем вырождаются. Однако, как и in vivo, клетки могут быть спасены от смерти путем лечения с помощью IDE и дантролена, как показано здесь. Методы патч-зажима используются для изучения калиевых оновых, онических, неселективных и дофаминовых транспортеров-зависимых каналов в культивируемых клетках морского элгана.

Из-за небольших размеров ячейки стеклянные пипетки должны иметь небольшой наконечник, а затем широкий конус, чтобы компенсировать повышенное входное сопротивление. Кроме того, больший успех достигается за счет подачи импульса высокого напряжения на участок мембраны под кончиком пипетки, а не при получении доступа ко всей клетке путем отсасывания, которое может повредить клетку. На этом рисунке для изучения роли потенциал-зависимых кальциевых каналов ION 4 используется для проникновения через мембрану и калибровки сенсорных нейронов, экспрессирующих хамелеон YC two point 12 для визуализации кальция в отсутствие или в присутствии кальция.

Кроме того, было определено, что средняя концентрация свободного кальция в контактных нейронах составляет 200 наномолярных моляров. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать и культивировать in vitro. Посмотрите на элегантность, эмбриональные клетки.