Метод для культивирования эмбриональных

Общая цель данной процедуры заключается в диссоциации и культивировании in vitro эмбриональных клеток sea elegant. Для этого сначала выращивают большое количество взрослых особей. Затем из взрослых особей изолируют яйца.

Затем яйца обрабатывают хитиназой для растворения яичной скорлупы. В завершение клетки подвергают ручной диссоциации и высевают для культивирования. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию клеточно-специфических маркеров с помощью иммунофлуоресценции, микроскопии, электрофизиологии и методов кальциевого имиджинга.

Процедуру продемонстрирует Rel Ti, постдок в лаборатории Mal. После культивирования как минимум четырех чашек с sea elegance до взрослой стадии GR и приготовления сред и растворов в соответствии с текстовым протоколом, приступите к изоляции яиц, предварительно подготовив пробирку со стоковым раствором арахисового лектина.

Поместите автоклавированные покровные стекла в лунки 24-луночного планшета, добавьте по 200 microliters арахисового лектина на каждое покровное стекло и инкубируйте в течение не менее одного часа при комнатной температуре. Затем аспирируйте раствор и промойте лунки стерильной водой, чтобы удалить все следы арахисового лектина и предотвратить агрегацию клеток.

Затем, используя стерильную автоклавированную воду, смойте взрослых особей GR с агариковых пластин и соберите суспензию в две стерильные конические пробирки объемом 50 milliliter. Поместите пробирки на лед на время до пяти минут, чтобы черви осели на дно. С помощью переносящей пипетки удалите воду и замените ее свежей стерильной автоклавированной водой. Центрифугируйте червей при 200 G в течение 10 минут.

После финальной промывки ресуспендируйте червей в свежей стерильной воде и перенесите их в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, затем снова центрифугируйте при 200 G в течение 10 минут. Если черви не осели полностью, поместите пробирку на лед на пять минут. Когда черви полностью осядут, удалите воду и добавьте от пяти до шести миллилитров лизирующего раствора.

Затем осторожно покачивайте суспензию в течение пяти–10 минут, и каждые две-три минуты наносите каплю суспензии на покровное стекло, чтобы проверить степень лизиса под стереомикроскопом. Когда лизис произойдет у 72–80% червей, остановите реакцию лизиса, добавив девять миллилитров яичного буфера. С этого момента зажгите горелку Бунзена и поддерживайте огонь, чтобы предотвратить повторное загрязнение яиц; осторожно удалите супернатант и используйте яичный буфер для тщательной промывки осадка три-четыре раза, пока раствор не станет прозрачным. Далее, после удаления последнего супернатанта для отделения яиц от останков животных, ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах стерильного яичного буфера и добавьте два миллилитра 60% сахарозы в яичном буфере.

Хорошо перемешайте яйца в растворе перед центрифугированием в течение 20 минут. После центрифугирования при 200 G осторожно извлеките пробирки из центрифуги. Яйца будут плавать на поверхности раствора.

Следовательно, с помощью дозатора и стерильных наконечников объемом 1 мл перенесите яйца в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Используя стерильный буфер для яиц, промойте яйца трижды, работая в ламинарном шкафу. Чтобы избежать бактериального загрязнения, суспендируйте осадок яиц в 1 мл киназы в концентрации 2 мг/мл и перенесите их в новую коническую пробирку объемом 15 мл.

Перемешивайте пробирку на качалке от 10 до 30 минут при комнатной температуре, в зависимости от свежести фермента, до тех пор, пока будет перевариваться примерно 80% яичной скорлупы. Центрифугируйте яйца при 900 G в течение трех минут. После осторожного удаления супернатанта добавьте три миллилитра среды L 15, перенесите яйца в чашку диаметром шесть сантиметров и начните ручную диссоциацию, используя стерильный шприц объемом 10 миллилитров с иглой 18 G.

Для контроля степени диссоциации поместите каплю суспензии в чистую чашку Петри и рассмотрите её под микроскопом. Продолжайте процедуру до тех пор, пока примерно 80% клеток не диссоциируют. Чтобы удалить клеточные комки, непереваренные яйца и вылупившиеся личинки, осторожно профильтруйте суспензию через пятимикронный фильтр, после чего пропустите через фильтр дополнительные четыре-пять миллилитров среды L 15 для восстановления клеток с целью их дальнейшего культивирования.

После центрифугирования фильтрата при 900 G в течение трех минут повторно суспендируйте клетки в полной среде L 15, добавляя по 1 мл в каждую лунку, и храните планшеты в герметичной влажной камере при 20 °C на открытом воздухе. Для дифференцировки изолированные эмбриональные клетки должны прикрепиться к субстрату. Процесс дифференцировки начинается примерно через два-три часа после посева и продолжается около 24 часов.

Морфологические особенности in vitro заметно схожи с признаками in vivo. Например, как показано здесь, нейроны LM и PLM развивают только два нейрита, один из которых длиннее другого, так же, как и in vivo. Это позволяет предположить, что по крайней мере некоторые молекулярные механизмы, управляющие дифференцировкой в клетках C. elegans, являются клеточно-автономными и, следовательно, могут быть воспроизведены.

Специфичные для конкретных типов клеток белковые маркеры и посттрансляционные модификации также могут быть изучены in vitro. Например, альфа-тубулин ацетилируется только в сенсорных нейронах прикосновения у sea elgan; как показано здесь, отростки сенсорных нейронов прикосновения in vitro окрашиваются антителом к ацетилированному альфа-тубулину. Кроме того, как видно на этой панели, культивируемые сенсорные нейроны прикосновения экспрессируют токсичный мутантный канал MEC four D, который вызывает гибель этих нейронов in vivo.

Нейроны, экспрессирующие GFP, приготовленные из штамма MEC four DPE 4G FP, изначально присутствуют в культуре, но затем подвергаются дегенерации. Однако, как и in vivo, клетки можно спасти от гибели путем обработки IDE и dantrolene, как показано здесь. Методы патч-клампа используются для изучения калиевых, неселективных ионных каналов, а также каналов, зависящих от транспортера дофамина, в культивируемых клетках sea elgan.

Из-за малого размера клетки стеклянные пипетки должны иметь узкий кончик и широкий конус для компенсации повышенного входного сопротивления. Кроме того, более высокая эффективность достигается при подаче высоковольтного импульса на участок мембраны под кончиком пипетки, чем при получении доступа ко всей клетке с помощью всасывания, которое может повредить клетку. На этом рисунке для изучения роли потенциалзависимых кальциевых каналов используется ION 4 для пермеабилизации мембраны и калибровки сенсорных нейронов, экспрессирующих chameleon YC 2.12, для визуализации кальция в присутствии или отсутствие кальция.

Кроме того, было установлено, что средняя концентрация свободного кальция в сенсорных нейронах составляет 200 nanomolar. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять и культивировать in vitro эмбриональные клетки C. elegans.