Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования Внутриутробное Электропорация

Целью этой процедуры является использование в утробе матери, электропорации, для визуализации и генетической манипулирования дендритами и шипами в коре головного мозга и гиппокампе мыши. Это достигается путем предварительного введения желаемого раствора плазмиды ДНК в боковой желудочек эмбрионов внутриутробно. Далее, используя разные положения электродов Palo.

Согласно инъекции ДНК, кора головного мозга или гиппокамп подвергаются электропоре, затем происходит желаемая постнатальная или взрослая стадия. Мышей перфузируют и собирают мозги. Наконец, мозг разрезается с помощью вибрама.

В конечном счете, дендриты и шипики могут быть визуализированы с помощью конфокальной микроскопии. Методика унитарной электропорации имеет ряд преимуществ по сравнению с методами исследования неправого рта и позвоночника. Действительно, эта методика позволяет сначала изучить этот аспект непосредственно in vivo.

Более того, по сравнению с генерацией нокаутных мышей в электроработе используется быстрый подход к изучению влияния подавления генов или экспрессии генов и позвоночника не только на специфическую клеточную структуру, но и на конкретный момент развития. Использование индуцируемой системы в межэлектроэнергетическом режиме также является полезным инструментом для определения функционального взаимодействия между генами, участвующими в письменном виде и развитии позвоночника. Действительно, в отличие от вирусов, например, нам тесно совместить несколько генов HNA или несколько тонн в одной популяции клеток Для начала разбавьте ДНК до нужных концентраций в воде и добавьте быстрый зеленый краситель до конечной концентрации 0,05%Используйте микроперпет-пуллер, чтобы вытащить стеклянные иглы для инъекций.

Поместите беременную мышь в анестезиологическую индукционную камеру с использованием изофтора и откройте кислород до двух литров в минуту. Когда животное теряет письменный рефлекс, переложите его на предоперационную маску. Нанесите каплю IGEL на каждый глаз и с помощью электрической бритвы сбрейте волосы на животе.

Один раз очистите выбритый участок хлоргексидином, чтобы собрать летящие волосы. Переложите животное во вторую маску в операционную зону, положив его спиной на грелку. Начинайте операцию, когда лепестковый рефлекс был утрачен

Наденьте маску и стерильные перчатки и накройте животное стерильной простыней. Очистите выбритый участок не менее трех раз хлоргексидином. С помощью скальпеля сделайте вертикальный разрез по средней линии кожи через кожу.

С помощью ножниц. Сделайте аналогичный разрез на мышце живота вдоль линейного локтя. Выбор наиболее доступных эмбрионов.

Поместите кольцевые щипцы между двумя эмбрионами и осторожно вытяните эмбриональную цепь из брюшной полости. С этого момента поддерживайте гидратацию эмбрионов с помощью стерильного предварительного подогрева PBS. С помощью кольцевых щипцов.

Аккуратно манипулируйте положением эмбриона внутри амниотического мешка и стабилизируйте голову между кольцами. Слегка сожмите, чтобы подтолкнуть эмбрион ближе к стенке матки. Другой рукой возьмите держатель капилляра и осторожно введите иглу в середину полушария, чтобы нацелиться на боковой желудочек.

Стараясь свести к минимуму перемещение иглы по поверхности стенки матки и не допуская прокалывания кровеносных сосудов, нажмите на педаль, чтобы ввести около 0,5 микролитров зеленого раствора ДНК. Поместите электроды по бокам головы эмбриона с положительной педалью на той же стороне, что и инъецируемый желудочек для электропорации коры головного мозга, или на противоположной стороне инъецируемого желудочка, на гиппокампе. Затем подайте пять электрических импульсов напряжением 30 вольт длительностью 50 миллисекунд с интервалом в одну секунду.

Чтобы увеличить шансы на выживание, сделайте инъекцию и электрооперацию всех эмбрионов менее чем за 30 минут после завершения в PBS, брюшной полости, и используйте кольцевые щипцы для замены маточного рога на его первоначальном месте. Используйте викриловые рассасывающиеся швы, чтобы закрыть живот, стенку и кожу. Поместите животное в камеру восстановления до тех пор, пока оно не проснется.

Затем переложите его в клетку на грелке через 24 и 48 часов после операции. Проверьте поведение мыши, чтобы оценить боль, страдания или дистресс, и взвесьте животное, чтобы проанализировать мозг. На постнатальных этапах используйте вибратор для срезов ранее перфузированных и постфиксных мозговых срезов в aqua poly mount для изображения дендритов и шипиков.

На этом рисунке показаны примеры электропорирования клеток в коре головного мозга, ca one и зубчатой извилине гиппокампа, в то время как мыши типа были электропорированы в точке E 14.5, где конструкция GFP и мозг были собраны на 14-й день после рождения. При введении небольшого объема раствора ДНК несколько клеток мечаются, что позволяет визуализировать дендритную арборизацию изолированных GFP-положительных клеток, а также их шипиков при большем увеличении. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о введении небольшого объема ДНК, чтобы нацелиться только на несколько клеток, а также иметь возможность визуализировать и количественно оценить то, что не нужно писать в позвоночнике или электронейросах.