Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования

Целью данной процедуры является использование электропорации in utero для визуализации и генетического манипулирования дендритами и шипиками в коре головного мозга и гиппокампе мыши. Это достигается путем предварительного введения раствора плазмидной ДНК в боковой желудочек эмбрионов in utero с последующим использованием электродов Palo в различных положениях.

После инъекции ДНК проводят электропорацию коры головного мозга или гиппокампа, затем выжидают до достижения нужной постнатальной стадии или взрослого возраста. Мышам проводят перфузию и извлекают головной мозг. В завершение мозг нарезают на срезы с помощью вибратома.

В конечном итоге, дендриты и шипики можно визуализировать с помощью конфокальной микроскопии. Метод единичной электропорации обладает несколькими преимуществами по сравнению с методами изучения дендритов и шипиков. В частности, эта техника позволяет изучать данные структуры непосредственно in vivo.

Более того, по сравнению с созданием нокаутных мышей, электропорирование является быстрым методом изучения эффекта супрессии или экспрессии генов в дендритах и шипиках не только в конкретных клеточных структурах, но и на определенном этапе развития. Использование индуцибельных систем при электропорировании также служит полезным инструментом для выявления функционального взаимодействия между генами, участвующими в развитии дендритов и шипиков. Действительно, в отличие от вирусов, например, нам гораздо проще комбинировать несколько последовательностей HNA или несколько генов-мишеней в одной и той же популяции клеток. Для начала разведите ДНК до необходимых концентраций в воде и добавьте краситель Fast Green до конечной концентрации 0.05%. Используйте микропуллер для вытягивания стеклянных игл для инъекций.

Поместите беременную мышь в камеру для индукции анестезии с использованием изофлурана и установите подачу кислорода на уровень 2 л/мин. Когда у животного пропадет рефлекс на сжатие лапы, переведите его на предоперационную маску. Нанесите каплю IGEL в каждый глаз и с помощью электрической бритвы выбрейте шерсть на брюшке.

Очистите выбритую область хлоргексидином один раз, чтобы собрать остатки волосков. Переместите животное под вторую маску в хирургической зоне, расположив его спиной на грелке. Приступайте к операции после исчезновения петального рефлекса.

Наденьте маску и стерильные перчатки, затем накройте животное стерильной салфеткой. Очистите выбритую область хлоргексидином не менее трех раз. С помощью скальпеля сделайте вертикальный разрез кожи по срединной линии.

С помощью ножниц сделайте аналогичный разрез мышц брюшной полости вдоль линейного сгиба локтя. Выберите наиболее доступные эмбрионы.

Поместите кольцевидный зажим между двумя эмбрионами и осторожно вытяните цепочку эмбрионов из брюшной полости. С этого момента поддерживайте гидратацию эмбрионов, используя стерильный предварительно подогретый PBS. Используйте кольцевидный зажим.

Осторожно измените положение эмбриона внутри амниотического пузыря и зафиксируйте голову между кольцами. Слегка сожмите, чтобы продвинуть эмбрион выше, ближе к стенке матки. Другой рукой возьмите держатель капилляра и аккуратно введите иглу в середину полушария, чтобы попасть в боковой желудочек.

Стараясь свести к минимуму движение иглы у поверхности стенки матки и избегая повреждения кровеносных сосудов, нажмите на педаль, чтобы ввести около 0.5 µL зеленого раствора ДНК. Для электропорации коры головного мозга поместите электроды по бокам головы эмбриона так, чтобы положительный электрод находился на той же стороне, что и введенный в желудочек раствор; для электропорации гиппокампа — на противоположной стороне от введенного раствора. Затем подайте пять электрических импульсов напряжением 30 V и длительностью 50 ms с интервалом в 1 s.

Избегайте подачи тока через плаценту, так как это приведет к гибели эмбрионов. Чтобы повысить шансы на выживание, введите вещества и проведите электропорацию всех эмбрионов менее чем за 30 минут; по завершении промойте PBS, верните эмбрионы в брюшную полость и с помощью кольцевидного зажима поместите рог матки в исходное положение. Используйте рассасывающиеся викриловые швы для закрытия брюшной стенки и кожи. Поместите животное в камеру восстановления до его пробуждения.

Затем перенесите животное в клетку на греющую подушку через 24 и 48 часов после операции. Оцените поведение мыши для выявления признаков боли, страданий или дистресса и взвесьте животное перед анализом мозга. На постнатальных стадиях используйте вибратом для секционирования предварительно перфузированного и зафиксированного мозга; смонтируйте срезы в aqua poly mount для визуализации дендритов и шипиков.

На этом рисунке представлены примеры электропорированных клеток в коре головного мозга, CA1 и зубчатой извилине гиппокампа у мышей, подвергнутых электропорированию на стадии E 14,5, с последующим введением конструкции GFP и забором материала мозга на 14-й постнатальный день. Путем инъекции малого объема раствора ДНК маркируются несколько клеток, что позволяет визуализировать дендритную арборизацию отдельных GFP-положительных клеток, а также их шипики при большем увеличении. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости введения малого объема ДНК, чтобы воздействовать лишь на несколько клеток, что позволит визуализировать и количественно оценить дендриты или шипики электропорированных нейронов.