Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования

В этом видео будут представлены два метода: биотинилирование клеточной поверхности и биотинилирование с погоней за пульсом. В следующей демонстрации мы будем использовать астроциты. Это наиболее распространенные типы глиальных клеток в мозге, и они экспрессируют наш интересный белок, которым является аквапорин-4.

Методы, которые мы используем в этой статье, могут быть применены ко многим различным типам клеток, и они могут включать в себя как клетки в суспензии, так и адгезивные клетки. Эти методы могут быть использованы для изучения экспрессии на клеточной поверхности и интернализации практически любого трансмембранного белка, если он обладает внеклеточным доменом, доступным для биотина. Общей целью данного анализа биотинилирования клеточной поверхности является определение влияния ламинина на экспрессию водопроницаемого канала Аквапорин-4 на плазматической мембране астроцитов.

Чтобы начать эту процедуру, извлеките культуры астроцитов из инкубатора, и выбросьте среду путем аспирации. Вымойте клетки трижды четырьмя миллилитрами охлажденного CM-PBS, и поставьте посуду на колотый лед. Извлеките CM-PBS методом аспирации, а затем внесите пипеткой по два миллилитра биотинового буфера в каждую лунку.

Осторожно наклоните посуду вперед и назад несколько раз, чтобы обеспечить полное покрытие, прежде чем поместить культуры на лед на 30 минут. После этого удалите биотиновый буфер, замените его четырьмя миллилитрами буфера для гашения и подержите культуры на льду в течение 10 минут. Далее отсадите и замените таким же количеством буфер для гашения, прежде чем оставить культуры на льду на 10 минут.

Затем выбросьте буфер для гашения и трижды промойте клетки четырьмя миллилитрами охлажденного CM-PBS. После этого соскребите клетки в один миллилитр охлажденного CM-PBS и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку. Затем гранулируйте клетки центрифугированием при 100 г в течение трех минут в охлаждаемой микроцентрифуге, установленной на четыре градуса Цельсия.

После этого выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса. Затем оставьте образцы на льду на 30 минут, переворачивая каждые пять минут. После этого центрифугируйте лизат при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать любые моющие и растворимые вещества.

Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Сохраните 50 микролитров лизата, и добавьте в него 25 микролитров трех загрузочных буферов X. Впоследствии денатурируйте его, нагрев до 95 градусов Цельсия в сухой бане.

Это входная фракция, содержащая как биотинилированные белки клеточной поверхности, так и небиотинилированные цитозольные белки. С помощью отрезанного наконечника пипетки перенесите 75 микролитров агарозных шариков стрептавидина в лизат, и инкубируйте его при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов на шейкере. После этого гранулы стрептавидина с агарозой методом центрифугирования при 1,500 г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.

Сохраните 50 микролитров надосадочной жидкости и добавьте 25 микролитров трех загрузочных буферов. Затем денатурируйте его при температуре 95 градусов Цельсия на водяной бане или в нагревательном блоке. Он представляет собой внутриклеточную фракцию и состоит в основном из небиотинилированных цитозольных белков.

После этого повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре буфера для промывки и раскачивайте его в течение трех минут при температуре четыре градуса Цельсия. Гранулируйте шарики и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.

Добавьте 50 микролитров загрузочного буфера, разбавленного до одного X с помощью буфера для лизиса. Высвободите биотин и стрептавидин из гранул, денатурировав их при 95 градусах Цельсия. Эта фракция должна содержать только биотинилированные белки клеточной поверхности.

Затем разделяют вход, поверхность клетки и внутриклеточные фракции с помощью SDS-PAGE и анализируют с помощью вестерн-блоттинга. Общая цель эксперимента по биотинилированию в погоне за пульсом заключается в определении приблизительной скорости интернализации аквапорина-4 в астроцитах. Сначала извлеките культуры астроцитов из инкубатора и аспирируйте среду.

Затем трижды промойте клетки четырьмя миллилитрами охлажденного CM-PBS и поставьте посуду на колотый лед. Аспирируйте CM-PBS, а затем пипеткой внесите три миллилитра биотинового буфера в каждую чашку. Наклоните посуду вперед и назад несколько раз, чтобы убедиться, что буфер хорошо распределен, и оставьте ее на льду на 30 минут.

Затем аспирируйте биотиновый буфер, и замените его пятью миллилитрами теплой среды. Одну чашку для культуры инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, а вторую чашку при той же температуре в течение 30 минут. Оставьте другую чашку при температуре четыре градуса Цельсия в качестве образца нулевой минуты.

По окончании инкубационного периода выбросьте среду и трижды промойте клетки четырьмя миллилитрами охлажденного CM-PBS. После этого аспирируйте CM-PBS, а затем пипеткой нанесите шесть миллилитров восстановительного буфера на клетки и оставьте образец на льду на 15 минут. Затем замените среду шестью миллилитрами свежего восстановительного буфера и поместите образец на лед еще на 15 минут.

Этот шаг имеет решающее значение, так как глутатион, содержащийся в восстановительном буфере, расщепляет биотиновый моазис, оставшийся на поверхности клетки. Это гарантирует, что только интернализованные белки будут помечены биотином. После этого удалите восстановительный раствор и замените его шестью миллилитрами буфера для гашения.

Оставьте образец на льду еще на 15 минут и повторите этап закалки еще раз. Затем выбросьте охлаждающий буфер и трижды промойте клетки четырьмя миллилитрами охлажденного PBS. Аспирируйте CM-PBS, а затем соскребите клетки в один миллилитр охлажденного PBS с помощью клеточного подъемника и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.

Гранулируйте клетки центрифугированием при 100 г в течение трех минут. Через три минуты выбросьте надосадочную жидкость, и снова суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса. Оставьте образец на льду на 30 минут, и делайте вихрь каждые пять минут.

Центрифугируйте лизат при 14 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать моющее средство и растворимые материалы. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Сохраните 50 микролитров этого лизата, и добавьте загрузочный буфер.

Впоследствии денатурируйте клетки при температуре 95 градусов Цельсия, в сухой ванне. Это входная фракция, содержащая как биотинилированные эндоцитозированные белки, так и небиотинилированные белки. С помощью отрезанного наконечника пипетки добавьте в лизат 150 микролитров агарозной суспензии стрептавидина и выдерживайте его при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов на шейкере.

Через три часа гранулы стрептавидина с агарозой методом центрифугирования, при 1500 г в течение 30 секунд, при четырех градусах Цельсия. Суспензируйте бусины в одном миллилитре буфера для стирки и раскачивайте их в течение трех минут при температуре четыре градуса Цельсия. Гранулируйте шарики, а надосадочную жидкость выбросьте.

Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков. Затем гранулируйте шарики центрифугированием при 1500 г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Выбросьте вышележащий буфер для стирки и добавьте 50 микролитров одного буфера для загрузки.

Высвобождайте биотин и стрептавидин из гранул, денатурируя при 95 градусах Цельсия. Эта фракция должна содержать только интернализованные белки клеточной поверхности. Затем разделите вход, поверхность клетки и несвязанные дроби с помощью SDS-PAGE и проанализируйте с помощью вестерн-блоттинга.

Здесь показаны поверхность клетки, внутриклеточные и общие фракции необработанных астроцитов, а также астроцитов, обработанных 24 наномолярным ламинином, зондированным на аквапорин-4 и бета-дистрогликан. Эта гистограмма иллюстрирует различия в уровнях аквапорина-4 на клеточной поверхности в необработанных и обработанных ламинином астроцитах, нормализованных по отношению к бета-дитрогликану. На этом рисунке интернализованные белковые фракции, собранные за нулевую, 15 и 30 минут, были исследованы на Аквапорин-4.

И эта гистограмма обобщает интернализацию аквапорина-4 для четырех независимых экспериментов, нормализованных по значениям для точки нулевой минуты. Звездочка указывает на статистически значимое увеличение количества Аквапорина-4, эндоцитозированного между 15 и 30 минутами. При использовании глутатиона для разрыва дисульфидной связи в расщепляемом аналоге биотина вклад аквапорина-4 клеточной поверхности в биотинилированную фракцию резко снижается.

В результате получается явная разница между образцами нулевой минуты и 15 минут. Если этот шаг пропущен, сигнал, исходящий от пула поверхности клетки, делает изменение между двумя временными точками незаметным. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как иммунофлюоресценция и микроскопия TIRF, чтобы ответить на дополнительные вопросы, включая физическую перевозку груза.