Микрочипов на основе идентификации отдельных HERV Loci выражение: применение к биомаркеров при раке простаты

Этот транскриптомный анализ тканей рака предстательной железы человека идентифицирует отдельные локусы экспрессии эндогенного ретровируса человека для оценки специализированного микрочипа высокой плотности в качестве инструмента скрининга для обнаружения биомаркеров. После того, как хирург удалил у пациента орган предстательной железы, патологоанатом отдельно подготавливает опухоль и прилегающие нормальные ткани в лабораторном экстракте, очищает и квалифицирует МРТ. НК из нормальных и опухолевых тканей амплифицируют мРНК с помощью набора для овации всего транскриптома, а затем расщепляют и маркируют полученные амплифицированные продукты. Затем последовательно обработайте два микрочипа H-E-R-V-V путем гибридизации заполнения, промывки и сканирования.

В конечном счете, с помощью биокомпьютерных методов можно отследить наборы зондов, демонстрирующие значительную сигнальную и дифференциальную экспрессию, что приведет к идентификации транскрипционно активных индивидуальных локусов. Много лет назад мы исследовали поведение семейства IRV W в различных контекстах, включая образцы рассеянного склероза. Плацента яичка.

Впервые у меня появилась идея о его методе, когда мы начали понимать, что перекрывающиеся или непересекающиеся подгруппы элементов IRV внутри семейства выражаются. В зависимости от контекста. Использование технологии судна позволяет координировать исследование нескольких его семейств и одновременный анализ различных регионов для каждого локуса.

Например, US 3 и UF домен для LTR, которые могут поддерживать прямую роль в патологии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака, например, для диагностики рака предстательной железы, где существующим белковым биомаркерам, таким как ПСА, не хватает специфичности и чувствительности. Между тем, некодирующие РНК, такие как PCA 3, кажутся более многообещающими, демонстрируя процедуру обработки простаты, Мишель будет продавать технику из отделения патологии.

Филипп Пер продемонстрирует подготовку и анализ мишени для извлечения РНК, в то время как техник из лаборатории John Unit продемонстрирует процедуру на корабле. Установите слой замороженной ткани вертикально на небольшой холмик ОКТ в криостате. Возьмите один срез размером пять микрон, окрасьте его Blu udine, затем проведите быстрое гистологическое исследование, чтобы изучить природу ткани на наличие опухолевой ткани.

Оцените количество туральных клеток и выберите только ядра с более чем 80% опухолевых клеток. Вырежьте еще один участок на пять микрон и заморочьте гематином, эоином и шафраном. Теперь разрежьте 15 участков толщиной 30 микрон и перенесите их в свободную от РНК пробирку.

Затем возьмите последний срез в пять микрон для окрашивания гематином, эоином и шафраном, чтобы контролировать количество опухолевых клеток. В конце процедуры trans переносит образцы на сухом льду в лабораторию молекулярной биологии. Гомогенизируйте ткань в растворе Триол на льду с помощью ручной кофемолки до полного растворения ткани.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте 300 микролитров хлороформа и вортекс на 15 секунд. Через две минуты при комнатной температуре центрифугируйте при 12 000 G в течение 15 минут при температуре от двух до восьми градусов Цельсия.

Для РНК осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавьте 750 микролитров изопропанола, перемешайте методом инверсии и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы для гранулирования осажденной РНК, промойте гранулу РНК одним миллилитром 80% этанола.

Затем центрифугируйте образцы при 7 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость с помощью наконечников Р 1000 и Р 10. Дайте оставшемуся этанолу высохнуть на воздухе.

Далее добавьте 100 микролитров свободной воды из РНК. Перенесите образцы в термоблок с температурой 70 градусов Цельсия. Чтобы растворить пеллету, проверьте качество РНК и целостность РНК с помощью биоанализатора и NanoDrop в соответствии с инструкциями производителя.

При идеальной экстракции РНК число целостности РНК обычно составляет семь или больше. Продолжайте использовать весь набор для овации транскриптома, амплификации РНК, следуя инструкциям поставщика. Затем очистите полученный одноцепочечный CD NA продукт.

Проверьте выход и распределение по размерам одноцепочечной КДНК с помощью биоанализатора и NanoDrop в соответствии с инструкциями производителя. Распределение по размерам амплифицированного CD NA обычно должно составлять от 101 500 оснований в длину с пиком около 600 оснований и иметь общее колоколообразное распределение. Затем для фрагментации CDNA добавьте 6,6 микролитров фрагментационной смеси к двум микрограммам CD NA в 30 микролитрах, отжимайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Затем инактивируйте ДНК при температуре 95 градусов Цельсия на 10 минут и держите на льду. Квотируйте один микролитр фрагментированной CDNA для проверки распределения по размерам на основе Agilent. Однократная обработка ДНК гомогенизирует распределение размеров CD NA примерно до 100 нуклеотидов перед гибридизацией.

Проверьте распределение по размерам одноцепочечного CD NA с помощью биоанализатора Pfizer pre-wet. Чип гена HERV с 200 микролитрами предварительной гибридизации. Перемешайте и инкубируйте при температуре 50 градусов Цельсия, 60 об/мин в течение 10 минут.

Добавьте 131 микролитр гибридизационной смеси к 69 микролитрам фрагментированного и меченого CD NA при комнатной температуре и в натуре в течение двух минут при 95 градусах Цельсия. Затем инкубировать при температуре 50 градусов Цельсия в течение пяти минут и центрифугировать на максимальной скорости в течение пяти минут. Теперь опорожните предварительно смоченный чип гена HERV и загрузите 200 микролитров целевого препарата.

Нанесите труднодоступные места на две гибридные SEPTA при температуре 50 градусов Цельсия, 60 об/мин в течение 18 часов. Опорожните чип гена HERV и заполните зонд. Поместите массив с 250 микролитрами буфера для промывки, поместите 600 микролитров смеси раствора SAPE и 600 микролитров смеси раствора антител в положения номер один и номер два, поместите 800 микролитров буфера для удержания матрицы в положение.

Номер три, вдавите иглы вниз. Назначьте подходящую микросхему для каждого модуля. Выберите протокол FS 4 5 0 0 0 4 и запустите каждый модуль в соответствии с инструкциями программного обеспечения.

Нанесите труднодоступные места на SEPTA, чтобы предотвратить протекание. Затем загрузите чип в автозагрузчик или непосредственно в сканер. Начните сканирование.

После сканирования чип-точки генерируются файлы CEL, проверьте изображение и выровняйте сетку по пятну, чтобы идентифицировать ячейки зонда. Также подвергните микросхемы нескольким измерениям контроля качества. Теперь нормализуйте чипы и примените иерархический кластерный подход для изучения набора данных после нормализации, был проведен значительный анализ для поиска дифференциально экспрессируемых генов из процедуры микрочипа, за которым последовала коррекция частоты ложных обнаружений на пяти образцах пар опухолей и нормальной РНК предстательной железы.

Это привело к идентификации 207 наборов зондов HERV с дифференциальными значениями экспрессии. Дальнейший анализ 35 дополнительных образцов пар совпадений из других раковых тканей выявил 44 набора HERV-зондов, специфичных для предстательной железы. Это 10 наиболее актуальных структур ГЕРВ.

Наконец, функциональный анализ может быть выполнен в специализированном интерфейсе, состоящем из аннотированных последовательностей, представляющих интерес, проиллюстрированных одним элементом H-E-R-V-W, выбранным в топ-10 идентифицированных провирусных структур, помеченных сверху с помощью специальных специфических зондов, присутствующих на матрице H-E-R-V-V two и помеченных функциональными ретровирусными областями LTR gag POLE N, и с акцентом на пять простых субдоменов LTRU three и U five. и последующая разработка праймеров для ПЦР для валидации ОТ-ПЦР. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как освоить критические этапы, связанные с подготовкой образцов и мишеней, которые являются качественными предпосылками для успешного использования микролучей для Земли, а также для обычного открытия биомаркеров. Мы разработали микрочип высокой плотности в формате аметри, целью которого является оптимальная характеристика индивидуальной экспрессии локусов, чтобы лучше понять, могут ли они быть активными при сухой транскрипции non-con-area NA или модуляции экспрессии кодирующих генов.

Этот метод открывает путь для исследователей в области хронических и инфекционных заболеваний, поскольку систематическая идентификация активных воколов может объединить генетические, вирусные и экологические гипотезы в качестве пусковых факторов при различных патологиях. Работа с ограниченным числом образцов в эксперименте по техническому подтверждению концепции может быть сложной задачей для успешного обнаружения биомаркеров, принятия мер предосторожности, таких как соблюдение статистически подтвержденного рабочего процесса, включая надежность метода, и репрезентативную выборку целевой популяции пациентов.