Следующее поколение тканей микрочипов (ngTMA) Протокол биомаркера исследований
23 сентября 2014 г.
Протокол направлен на оптимизацию конструкции и качество ткани микрочипов для биомаркеров исследований. Она включает в себя аспекты планирования и проектирования, цифрового патологии, виртуального слайд аннотации и автоматизированной ткани выстроив.
Целью данной процедуры является создание оптимальных или целевых тканевых микрочипов для последующего использования в исследовании биомаркеров. Во-первых, создается цифровой архив слайдов из репрезентативных слайдов тканей. Гистологические области интереса аннотированы на цифровых предметных стеклах, чтобы указать точные области соответствующих донорских блоков, которые должны быть перенесены в тканевый микрорентгеновский блок.
После того, как дизайн и макет тканевых микрочипов созданы, донорные блоки автоматически пробиваются, а причина загружается в тканевые микрочипы. Используя этот точный, быстрый и автоматизированный подход нового поколения, точные гистологические области или даже определенные группы клеток могут быть точно захвачены и перенесены на тканевый микрочип. Основным преимуществом нашей методики перед существующими методами тканевого микрокольца, такими как использование самодельного или полуавтоматического устройства, безусловно, является гистологическая точность.
Это достигается за счет сочетания сильных сторон цифровой патологии с гистологической экспертизой, а также автоматизированного тканевого микрокольца, демонстрирующего процедуру сегодня, Калин Хамман и Хосе Гальван. Две технические помощи от нашей лаборатории Использование программного обеспечения для сканирования. Сначала выберите автоматический режим сканирования светлого поля.
Затем нажмите на параметры сканирования, чтобы настроить параметры качества слайда. Теперь выберите сохранение сканов слайдов локально или в веб-версии, щелкнув параметры сервера и установив место назначения сканирования в центр случая. Теперь подготовьте слайды перед загрузкой слайдов в журнал Для сканера убедитесь, что слайды чистые.
При необходимости очистите их С помощью этанола можно загрузить до 25 слайдов в каждый магазин, а сканер может загрузить до 10 магазинов. Несколько магазинов складываются друг на друга, когда они заряжены. Как только слайды будут загружены, укажите все слайды, имена файлов и установите папку сохранения в центре кейсов.
Теперь начните сканирование слайда, нажав на зеленую стрелку. В этом разделе места, из которых образцы тканей пробиваются на предметном стекле, задаются аннотациями к цифровому предметному стеклу. Начните с открытия папки с цифровыми слайдами.
В программном обеспечении для просмотра можно вносить изменения в саму папку. Можно добавлять заметки, изменять порядок слайдов, а также устанавливать привилегии пользователей и вложения. Теперь начните комментировать слайды, нажав на один из них.
Он появится в просмотрщике. В просмотрщике. Используйте инструмент увеличения, чтобы оценить слайд и найти интересующие области для интеграции в TMA следующего поколения.
С помощью инструмента аннотации TMA выберите размер желаемого керна и цвет аннотации. Прикрепите эту аннотацию к слайду, щелкнув по слайду. Затем переместите аннотацию к нужным гистологическим структурам.
Эти аннотации отмечают места пуансонов на соответствующем тканевом блоке. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все слайды не будут аннотированы. Альтернативным вариантом для тканевой причины является отправка их в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра для молекулярного анализа.
Аннотируйте слайды, используя метку другого цвета, чтобы отличить эти пятна от тех, которые являются TMA. После того, как все аннотации будут созданы, сохраните файл электронной таблицы, содержащий список всех слайдов с соответствующими аннотациями и цветами аннотаций. Начните микрореконструкцию ткани с извлечения соответствующих парафиновых блоков ткани для всех аннотированных цифровых слайдов.
Вызываются блоки-доноры. Отсортируйте блоки в том же порядке, что и цифровые слайды. Убедитесь, что толщина каждого блока должна быть не менее четырех миллиметров.
Если нет, ткань нужно будет заново изобретать за компьютером. Откройте тканевый микрочип программного обеспечения и введите название проекта. Перейдите к смене инструмента и выберите необходимый диаметр инструмента.
Теперь загрузите в автомат до 12 блоков-получателей. Обратите внимание на названия блоков. Все они должны быть помечены с использованием одной и той же системы нумерации для обеспечения единообразия.
Затем в программном обеспечении присвойте соответствующее имя каждому из блоков, чтобы создать макет TMA. Во-первых, создайте новый дизайн TMA, назначив количество строк, столбцов, пустых строк и интервалов между пуансонами. Сохраните макет и назначьте его блоку.
Затем повторите процесс для следующего блока. При использовании нового макета или того же макета размеры ядер могут варьироваться между блоками-получателями. Далее загрузите в автомат до 60 блоков-доноров.
В каждый ряд помещается до 10 блоков. A через F. Оставшиеся донорские блоки будут загружены позже в программное обеспечение. Дайте каждому блоку-донору идентифицирующее имя.
Изображение каждого блока будет получено автоматически. Теперь совместите цифровые слайды с соответствующими блоками-донорами. Сначала выберите блок.
Затем нажмите на слайд и сравните изображения слайда и блока рядом друг с другом. Выберите опорные точки на изображении блока-донора, которые соответствуют конкретным точкам на соответствующем цифровом слайде. Затем нажмите далее, и аннотации переместятся на изображение блока-донора.
Если аннотации верны, нажмите на каждую из них, чтобы подтвердить ее расположение. Затем нажмите «Начать». Это побуждает микрочип просверлить отверстие в контрольной точке в блоке-реципиенте, а затем пробить отверстие в блоке-доноре в том же месте и перенести керн в блок-реципиент.
Чтобы собрать керны в ПЦР-пробирку, нажмите на инструмент ПЦР для блока. Для подачи ткани в трубку можно использовать до четырех аннотаций. Как только они будут установлены, нажмите «Старт», и донор будет вызван и трубка будет загружена.
После станка сверлят и пробивают керны, обновляют изображение донорского блока. Продолжайте повторять выравнивание и аннотирование для следующего блока. Затем удалите сердцевину.
Продолжайте делать это для каждого донорского блока. Это будет в ТМА. Когда первый набор из 60 блоков-доноров будет завершен, выгрузите их и загрузите еще 60 блоков.
Продолжайте процесс до тех пор, пока все блоки-доноры не будут выстроены в порядок. После взятия около 500 ядер очистите сверло, и пробивной инструмент начнет работать. Когда массивы будут готовы, экспортируем проект.
Файл таблицы с данными проекта будет находиться в папке экспорта. Он показывает расположение каждой выборки в каждом блоке TMA. Затем сохраните изображения блока-донора с наложенными аннотациями в виде файлов JPEG в папку экспорта.
На этом процесс генерации блока TMA завершен. На этой схеме TMA показаны шесть блоков NG TMA, которые были построены в двух экземплярах для 12 последних блоков для заполнения массива. Каждый опухолевый блок содержал 402 тканевых пятна, а каждый нормальный тканевый блок содержал 268 пятен.
После того, как 60 донорских блоков были аннотированы, причина была пробита. Время переноса ядра составило примерно 12 секунд. Потери ядра были минимальными, а общее время работы над массивом в этом проекте составило в общей сложности около 24 часов.
Это включало время, затраченное на определение причины для последующего молекулярного анализа после процесса N-G-T-M-A. Другие методы, такие как иммуногистохимия при цитогибридизации и даже специальные окрашивания, могут быть применены к этим тканевым микрочипам, чтобы ответить на некоторые вопросы, например, какие гены или белки экспрессируются или даже изменяются в различных тканях.
Обзор
В данном протоколе описывается процесс создания и оптимизации тканевых микромассивов для исследования биомаркеров. В работе сочетаются методы цифровой патологии и автоматизированного формирования тканевых массивов для повышения гистологической точности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследование биомаркеров
- Технология тканевых микромассивов
- Цифровая патология
Теоретическое обоснование
- Тканевые микромассивы необходимы для высокопроизводительного анализа биомаркеров.
- Архивы цифровых слайдов облегчают точную аннотацию гистологических областей.
- Автоматизированные процессы повышают эффективность и точность отбора проб тканей.
- Экспертные знания в области гистологии имеют решающее значение для оптимального выбора тканей.
Цель исследования
- Для создания таргетных тканевых микроматриц для исследования биомаркеров.
- Для повышения точности отбора проб тканей за счет автоматизации.
- Для оптимизации процесса аннотирования цифровых слайдов и переноса тканей.
Используемые методы
- Создание архивов цифровых слайдов на основе репрезентативных срезов тканей.
- Аннотирование гистологических областей интереса на цифровых слайдах.
- Автоматизированный забор кернов из донорских блоков для создания тканевых микромассивов.
- Использование программного обеспечения для проектирования TMA и управления их разметкой.
Основные результаты
- Успешное создание тканевых микромассивов с высокой гистологической точностью.
- Эффективный перенос целевых образцов тканей в реципиентные блоки.
- Оптимизация рабочего процесса за счет автоматизации и интеграции цифровой патологии.
- Создание подробной таблицы данных проекта для дальнейшего анализа.
Выводы
- Данный протокол значительно повышает качество тканевых микромассивов.
- Сочетание цифровой патологии с автоматизированными методами позволяет получить точные результаты.
- Этот подход имеет преимущества по сравнению с традиционными методами создания тканевых микромассивов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Технология тканевых микромассивов нового поколения (ngTMA) отвечает критической потребности в точном и воспроизводимом отборе проб тканей для поиска и валидации биомаркеров. Благодаря интеграции цифровой патологии с автоматизированным формированием массивов, ngTMA повышает гистологическую точность и пропускную способность, напрямую поддерживая рабочие процессы по валидации мишеней и разработке методов анализа. Данный подход снижает уровень биологического шума в доклинических моделях, повышая прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений и в трансляционных исследованиях биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем забора специфических гистологических областей, таких как центр опухоли, фронт инвазии и метастатические очаги, для функциональной валидации мишеней.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет точной аннотации зон ткани, что уменьшает механистическую неопределенность в исследованиях взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем создания стандартизированных тканевых образцов из аннотированных областей, что обеспечивает достоверность оценки соединений.
- Операционная ценность: Решение вопросов стандартизации и воспроизводимости анализа с помощью автоматизированного вырезания образцов и цифрового сопоставления срезов, что гарантирует единообразие подготовки проб в разных сериях экспериментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Рассматривается значимость для изучения заболеваний и согласованность трансляционных биомаркеров путем включения нескольких типов тканей/гистологических зон (например, опухоли, лимфатических узлов, метастазов в печени, нормальной ткани) из образцов пациентов.
- Практическая ценность: Описывается непрерывный процесс от этапа поиска до доклинической валидации за счет создания нескольких копий ngTMA для параллельного анализа методами иммуногистохимии, гибридизации in situ и специальных окрасок.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
ngTMA интегрируется в континуум исследований — от раннего этапа поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических работ, предоставляя количественные данные о тканях с пространственным разрешением, которые позволяют проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути.
- Открывающая биология: объясняет, как метод способствует проверке гипотез, уточнению путей или снижению биологических рисков за счет точного выделения интересующих гистологических областей с помощью цифровой аннотации.
- Скрининг: описывает готовность анализа, воспроизводимость или количественные результаты (если это подтверждено в статье) за счет автоматизированного массива аннотированных областей, формирующих стандартизированные тканевые споты.
- Аналитика: выделяет измерения, показатели или статистические данные, которые помогают группам исследователей сравнивать условия с помощью цифровой аннотации слайдов и экспорта данных проекта для дальнейшего анализа.
- Трансляционные исследования: связывает метод с преклинической непрерывностью или согласованием биомаркеров только в тех случаях, когда источник подтверждает возможность применения ИГХ, ИГН и специальных окрашиваний на ngTMA для оценки экспрессии белков/генов в различных зонах ткани.
- Корпоративное повторное использование: представляет метод как многократно используемую возможность, а не как одноразовую технику, за счет создания нескольких копий ngTMA и архивирования цифровых слайдов для будущих исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков.
Особенности реализации
- Необходимый уровень научной компетенции в области гистологии, цифровой патологии и проектирования тканевых микромассивов.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая автоматический аппарат для создания тканевых массивов, сканер слайдов и веб-платформу для аннотирования.
- Требования к межкомандной стандартизации протоколов аннотирования, маркировки блоков и управления данными.
- Особенности адаптации для различных модельных систем, таких как разные типы тканей, размеры кернов и объемы образцов пациентов.
- Практические ограничения, подтвержденные исходными данными, включая время аннотирования (2-3 min/case), требования к сканированию (3 ночных запуска для 134 пациентов) и время формирования массивов (15-20 hr).
