Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для

Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы провести в C два измерения локальных физических свойств бактериальной биопленки на микрометровом уровне. Для этого в растущую биопленку вводятся магнитные частицы, которые служат зондами, способными приводиться в движение дистанционно, не нарушая структурных свойств биопленки. Затем используются специальные магнитные пинцеты для воздействия определенной силы на каждую частицу.

Смещение частиц, внедренных в биопленку и вызванное магнитным притяжением, контролируется с помощью видеомикроскопии для определения локальных вязкоупругих параметров и получения трехмерного пространственного распределения механических свойств биопленки. Полученные результаты демонстрируют механическую неоднородность биопленки E. coli и позволяют понять, какие компоненты определяют физические свойства биопленки. Таким образом, основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как микроскопия, колониальный анализ или исследование всей биомассы, является возможность определения пространственного распределения механических свойств in situ без нарушения исходной структуры материала.

Для подготовки магнитных частиц в соответствии с данным протоколом перемешайте исходный флакон с частицами размером 2,8 мкм на вортексе для их ресуспендирования. Затем перенесите 10 µL в микроцентрифужную пробирку. Для промывки частиц добавьте 190 µL минимальной среды и перемешайте содержимое пробирки круговыми движениями, поместите ее на магнитный штатив, дождитесь образования осадка и аспирируйте супернатант.

Повторите этот этап промывки еще два раза и ресуспендируйте гранулы в 190 µL минимальной среды. Затем добавьте 950 µL среды M 63 B one с 0,4% glucose к 50 µL раствора промытых гранул, чтобы довести концентрацию частиц примерно до 5 миллионов гранул на миллилитр. Для подготовки канала с помощью алмазного стеклореза разрежьте две квадратные боросиликатные стеклянные капилляры длиной 10 см, чтобы получить два фрагмента длиной 8 см.

С помощью стеклореза разрежьте предметное стекло пополам. Затем, используя быстрозастывающий цианоакрилатный клей или суперклей, прикрепите два капиллярных отрезка к двум частям предметного стекла, как показано на этой схеме. Расположите их на расстоянии 2 cm друг от друга с выступом в 1 cm с каждого конца, после чего автоклавируйте всю установку и необходимые трубки.

Для дальнейшего соединения каналов соберите следующие стерильные материалы под ламинарным потоком воздуха: смонтированные трубки и коннекторы каналов, два педиатрических пузырьковых фильтра или ловушки, два зажима, шприцы объемом 30 мл, заполненные раствором M 63 B с 1,4% глюкозы, и бутыль для отходов.

Аналогичным образом соедините два капилляра. Используя одну из трубок, подсоедините бутыль для отходов к одному из концов капилляра.

Затем, используя соединители с люер-локом в качестве переходников, подсоедините другой конец капилляра к самодельной ловушке для пузырьков или последовательно соедините первую ловушку со второй. После этого подсоедините шприц объемом 30 мл с раствором M 63 B one ко второй ловушке. Далее заполните систему стерильным раствором M 63 B one с 0,4% glucose.

Установите шприц в шприцевой насос и включите насос, установив скорость потока примерно на пять миллилитров в час выше экспериментальной скорости. Внимательно отследите и при необходимости удалите все пузырьки воздуха из контура. В процессе выполнения этой процедуры отсоедините и снова подсоедините контур.

Следите за тем, чтобы удалить все пузырьки воздуха перед введением смеси клеток и частиц в трубку; для обеспечения непрерывного роста биопленки рекомендуется расположить емкость для сбора отходов выше капилляров. Позвольте среде протекать через систему в течение 10–15 минут. Тем временем в микроцентрифужной пробирке смешайте 1 мл бактериальной суспензии с оптической плотностью 0,5 с 1 мл ранее подготовленного раствора промытых микросфер.

Выключите поток, заново подсоедините трубки и закройте зажимы. Затем наберите в шприц объемом 1 мл смесь бусин с бактериями и введите её в капилляр. После самодельной ловушки для пузырьков перенесите аппарат под микроскоп.

Установите капилляр на предметный столик микроскопа, а контейнер для отходов расположите чуть выше. Поместите шприцевой насос на столешницу рядом с микроскопом. Оставьте установку на 15–20 минут, чтобы бактерии осели и прикрепились к поверхности капилляра.

После того как бактерии прикрепились к капилляру, откройте зажимы, настройте скорость потока на шприцевом насосе и запустите поток. В течение 24–48 часов на поверхности капилляра сформируется биопленка; сфокусируйтесь на нижней плоскости капилляра и начните запись серии изображений образца с интервалом времени. Обычно частоты сбора данных из двух изображений в минуту достаточно для надлежащей регистрации роста биопленки.

На данном видео показана начальная стадия формирования биопленки сразу после введения смеси клеток и частиц. При записи в капилляре частота составляла один кадр в секунду, а воспроизведение видео осуществляется со скоростью 10 кадров в секунду. После четырех часов роста частицы постепенно отделялись от поверхности, распределяясь по всему объему биопленки.

Синие стрелки обозначают события отрыва. Частота получения изображений составляет два кадра в минуту, видео воспроизводится со скоростью 15 кадров в секунду. После 20 часов роста в фокальной плоскости можно наблюдать за десятком равномерно распределенных частиц.

Данное видео снято в срединной плоскости, на высоте 20 micrometers над дном капилляра. Снималось по два изображения в минуту. Видео воспроизводится со скоростью 15 кадров в секунду.

После того как биопленка, засеянная магнитными частицами, начнет расти, закрепите магнитные пинцеты на предметном столике микроскопа. Чтобы обеспечить создание соответствующих градиентов магнитного поля в зоне наблюдения, убедитесь, что пинцеты расположены так, как показано на данной диаграмме, где область измерения, отмеченная красным, находится на расстоянии 300 micrometers от краев левого и правого полюсов пинцетов по оси Y. Дно капилляра должно располагаться на 200 micrometers ниже нижней части пинцетов.

Для выполнения этого этапа используйте управление перемещением по осям XY предметного столика микроскопа, чтобы совместить край левого магнитного полюса с левым краем капилляра. В том же поле зрения с помощью шкалы X левого микроманипулятора пинцета отрегулируйте положение полюса так, чтобы он находился на расстоянии 300 micrometers от края капилляра. Повторите ту же операцию с правой стороны.

Затем отрегулируйте положение пинцета по оси Z относительно дна капилляра. Сначала совместите нижнюю часть электродов с дном капилляра, после чего сместите электроды на 200 micrometers вверх.

С помощью регулятора Z микроманипулятора установите параметры генератора функций следующим образом: 24 секунды нулевого сигнала и 16 секунд тока силой 4 А. Подайте постоянный ток с триггером. Подайте сигнал на затвор освещения в светлом поле через 20 секунд.

Для синхронизации сигналов подключите пинцет к генератору функций через усилитель мощности. Убедитесь в правильном последовательном соединении полюсов для получения пространственно распределенных кривых ползучести. Определите пространственное начало координат, установив начало оси Z у внутреннего дна капилляра.

Зафиксируйте положение контроля по оси Z микроскопа. Затем найдите точку пересечения осей X и Y, которые определяются краем капилляра и краем полюса соответственно. Эта точка является началом координат для анализа.

Запишите координаты. Все последующие координаты будут отсчитываться относительно данного начала координат. После того как биопленка вырастет, с помощью ручки точной фокусировки отрегулируйте вертикальное положение капилляра так, чтобы первая плоскость находилась на высоте от 4 до 7 мкм над дном капилляра.

Этот срез соответствует срезу биопленки, в котором начало координат пространственной системы отсчета находится в верхнем левом углу. Затем включите генератор тока и вручную запустите последовательность получения изображений. Для инициации 42-й последовательности событий поток изображений, полученный здесь, будет соответствовать заданной плоскости и полю XY.

После фиксации последовательности переместите капилляр, чтобы записать видео нового поля. Повторяйте этот процесс до получения всех необходимых видео для анализа данных. Откройте изображения в Image J или эквивалентном программном обеспечении для трекинга частиц для всех стеков, полученных для всех частиц.

Преобразуйте изображения в текстовые файлы, отслеживая смещение частиц. Затем с помощью программного обеспечения для обработки данных постройте кривые смещения и преобразуйте их в кривые податливости, в которых общая податливость материала JFT рассчитывается как функция времени согласно представленной здесь формуле податливости. Эта формула описывает зависимость между приложенным напряжением и деформацией материала для частицы, встроенной в вязкоупругую и несжимаемую среду, как было установлено ранее [автор] и его коллегами. На основании аппроксимации кривой податливости при ползучести общей моделью Бургера для вязкоупругих материалов определите вязкоупругие параметры J zero, J one, at the zero, at the one prime для получения пространственного распределения вязкоупругих свойств биопленки. Кривые ползучести были получены на разных глубинах в микрообъеме биопленки размером примерно 200 by 200 by 40 cubic micrometers. Типичные результаты показаны здесь.

Значения J₀ (податливости при упругой деформации) представлены в виде функции оси Z, соответствующей глубине, и оси y, соответствующей поперечному размеру биопленки. Каждая точка соответствует микросфере, для которой в результате анализа кривой ползучести было определено значение J₀. Данные показывают, что локальная податливость варьирует по глубине биопленки почти на три порядка.

Кроме того, на всех высотах биопленки наблюдалась выраженная латеральная неоднородность. Данные также позволяют определить распределение значений податливости, которое имеет широкий и асимметричный характер. Сравнение этих результатов с данными, полученными ранее для других биологических полимеров, позволяет предположить, что механические свойства биопленки обусловлены наличием высокосшитых полимерных гелей.

В пункте C также были проведены два измерения локальных свойств биопленки при различных условиях окружающей среды, например, при более низкой скорости потока, как показано здесь. Значения податливости биопленки, выращенной при скорости 0.1 milliliter per hour, по-прежнему демонстрируют крайне неоднородный механический профиль. Однако отчетливая зависимость жесткости биопленки от глубины Z, наблюдавшаяся при выращивании биопленки при скорости one milliliter per hour, исчезла.

Эти результаты демонстрируют значительное влияние внешних условий на организацию биопленки. После просмотра видео вы должны хорошо понимать, как картировать вязкоупругие свойства биопленки в условиях полностью контролируемого роста.