Дистанционное Магнитный Приведение в микрометрической зондов для На месте 3D Mapping бактериальных биопленок физических свойств

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы провести в С два измерения локальных физических свойств бактериальной биопленки в микрометрическом масштабе. Для этого магнитные частицы вводятся в растущую биопленку, которые служат зондами, которые можно дистанционно приводить в действие без нарушения структурных свойств биопленки. Затем специальный магнитный пинцет используется для приложения определенной силы к каждой частице.

В встроенной в биопленку пленке происходит мониторинг смещения частиц, вызванного магнитным растяжением, с помощью видеомикроскопии для получения локальных вязкоупругих параметров и обеспечения трехмерного пространственного распределения механических свойств биопленки. Получены результаты, которые показывают механическую гетерогенность биопленки E. coli и дают ключ к пониманию того, какие компоненты биопленки поддерживают физические свойства биопленки. Таким образом, основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как микроскопия, кология или полная биорастительность, заключается в том, что он сообщает о пространственном распределении механических свойств in situ, не нарушая исходную структуру материала.

Чтобы подготовить магнитные частицы для этого протокола, в штатном флаконе vortex с частицами размером 2,8 микрометра нужно их ресуспендировать. Затем переложите 10 микролитров в микроцентрифужную пробирку. Затем для промывки частиц добавьте 190 микролитров минимальной среды и закрутите пробирку, поместите ее на магнитный штатив для образцов, дождитесь образования гранулы и отаскайте супернат.

Повторите этот шаг промывки еще два раза и снова суспендируйте бусины в 190 микролитрах минимальной среды. Затем добавьте 950 микролитров M 63 B с 0,4% глюкозы в 50 микролитры раствора промытых шариков, чтобы довести концентрацию частиц примерно до 5 миллионов гранул на миллилитр. Чтобы подготовить канал, с помощью алмазного стеклореза разрежьте два квадратных капилляра из силикатного стекла длиной 10 сантиметров, чтобы получить два восьмисантиметровых кусочка.

С помощью стеклореза разрежьте предметное стекло пополам. Затем с помощью быстродействующего цианоакрилатного клея или суперклея прикрепите два капилляра к двум предметным стеклам, как показано на этой схеме. На расстоянии двух сантиметров друг от друга, с одним сантиметровым выступом на обоих концах, автоклавируется вся установка и необходимые трубки.

Для дальнейшего подключения канала соберите следующие стерильные материалы под ланарным проточным колпаком. Смонтированы трубки канала и соединители, два педиатрических пузырьковых фильтра или ловушки. Два зажима, 30 миллилитровые шприцы, наполненные М 63 В, 1,4% глюкозы и бутылка с отходами.

Соедините два капилляра таким же образом. С помощью одной из трубок. Подсоедините бутылку для отходов к одному капиллярному концу.

Затем, используя разъемы для замка приманки в качестве соединений, подключите другой конец капилляра к самодельной пузырьковой ловушке или ловушке один и ловушке номер один к ловушке два. Затем подсоедините 30 миллилитр М 63 В одним шприцем к ловушке два. Далее заполнить установку стерильным М 63 В с 0,4% глюкозы.

Установите шприц на шприцевой насос и включите шприцевой насос со скоростью примерно на пять миллилитров в час выше экспериментальных показателей. При необходимости тщательно отслеживайте и устраняйте все пузырьки в цепи. Отсоедините и снова подключите цепь во время выполнения этой процедуры.

Будьте осторожны, чтобы удалить любые пузырьки до и во время введения смеси клеточных частиц в трубку, это помогает разместить мусор над капиллярами, и это поможет непрерывному росту биопленки. Дайте среде протечь через систему в течение 10–15 минут. Тем временем в микроцентрифужной пробирке смешайте один миллилитр бактериальной суспензии с оптической плотностью 0,5 с одним миллилитром приготовленного ранее раствора промытых шариков.

Выключите поток, снова подсоедините трубку, а затем закройте хомуты. Затем наполните одномиллилитровый шприц смесью бактерий и введите ее в капилляр. После самодельной ловушки для мыльных пузырей перенесите туда аппарат в микроскоп.

Установите капилляр на предметный столик для микроскопа и поместите контейнер для отходов на немного более высоком уровне. Поставьте шприцевой насос на столешницу рядом с микроскопом. Дайте аппарату постоять от 15 до 20 минут, чтобы бактерии могли осесть и прикрепиться к поверхности капилляра.

Как только бактерии прикрепятся к капилляру, откройте зажимы и отрегулируйте скорость потока на шприцевом насосе и запустите поток. В течение 24-48 часов биопленка будет развиваться на поверхности капилляра, фокусироваться на плоскости дна капилляра и начнет покадровую запись изображений образцов. Обычно частота получения двух изображений в минуту позволяет адекватно сообщить о росте биопленки.

В этом фильме показана начальная стадия создания биопленки сразу после введения смеси клеточных частиц. При капиллярном захвате частота составляет одно изображение в секунду, а фильм воспроизводится со скоростью 10 кадров в секунду. После четырех часов роста частицы постепенно отделяются от поверхности и распределяются по объему биопленки.

Синими стрелками отмечены события отряда. Здесь частота захвата составляет два изображения в минуту, а фильм воспроизводится со скоростью 15 кадров в секунду. После 20 часов роста в фокальной плоскости можно наблюдать за десятком равномерно распределенных частиц.

Этот фильм снят в средней плоскости, на высоте 20 микрометров над капиллярным дном. В минуту делалось два снимка. Фильм воспроизводится со скоростью 15 кадров в секунду.

После того, как биопленка, засеянная магнитными частицами, начнет расти вручную, прикрутите магнитный пинцет к предметному столику микроскопа. Чтобы обеспечить создание соответствующих градиентов магнитного поля в зоне наблюдения, убедитесь, что пинцет расположен так, как показано на этой схеме, где область измерения, показанная красным цветом, расположена на расстоянии 300 микрометров от краев левого правого полюса пинцета по оси Y. Дно капилляра располагается на 200 микрометров ниже дна пинцета.

Чтобы выполнить этот шаг, используйте управление движением XY предметного столика микроскопа, чтобы переместить край левого магнитного полюса и левый край капилляра. В том же поле наблюдения отрегулируйте положение полюса на расстоянии 300 микрометров от края капилляра с помощью х-образного диска левого микромного манипулятора пинцета. Проделайте ту же операцию с правой стороны.

Затем отрегулируйте положение пинцета по оси Z по отношению к дну капилляра. Сначала совместите нижнюю часть столбов с нижней частью капилляра и сдвиньте полюса. 200 микрометров вверх.

С помощью Z-диска микроманипулятора установите параметры генератора функций на 24 секунды нулевого сигнала и 16 секунд на четыре ампера. Постоянный ток с триггером. Отправьте на светлое поле свет затвора через 20 секунд.

Для синхронизации сигнала подключите пинцет к функциональному генератору через усилитель мощности. Обратите внимание на правильное последовательное соединение полюсов, чтобы получить пространственно распределенные кривые ползучести. Возьмите пространственное начало координат, возьмите начало координат оси Z на внутреннем дне капилляра.

Обратите внимание на положение микроскопа по оси Z. Затем найдите пересечение осей X и Y, которые определяются краем капилляра и краем полюсного наконечника соответственно. В этом и заключается происхождение анализа.

Запишите координаты. Все координаты будут взяты относительно этого начала координат в нижеследующем. Как только биопленка вырастет, с помощью ручки точного управления фокусировкой отрегулируйте вертикальное положение капилляра так, чтобы первая плоскость располагалась на четыре-семь микрометров выше дна капилляра.

Этот срез соответствует срезу биопленки, в котором начало пространственной референции расположено в верхнем левом углу. Затем включите генератор тока и вручную запустите последовательность получения изображения. Чтобы инициировать 42-ю последовательность событий, полученный здесь поток изображений соответствует заданной плоскости и полю XY.

После захвата последовательности переместите капилляр, чтобы захватить видео нового поля. Продолжайте повторять этот процесс, чтобы получить все необходимые видео для анализа данных. Откройте изображения на изображении J или в аналогичной программе для отслеживания частиц для всех стеков, собранных во всех частицах.

Преобразуйте изображения в текстовые файлы, отслеживая смещение частиц. Затем, используя программное обеспечение для обработки данных, нарисуйте кривые смещения и преобразуйте кривые смещения в кривые податливости, в которых общая податливость материала JFT рассчитывается как функция времени в соответствии с приведенной здесь формулой соответствия. или внедрены в вязкоупругую и несжимаемую среду как это было установлено ранее, и его коллеги От корректировки кривой податливости ползучести до общей модели Бюргерса для вязкоупругих материалов получены вязкоупругие параметры J ноль J один на нуле на одном простом для обеспечения пространственного распределения вязкоупругих свойств кривых ползучести биопленки собраны на разных глубинах в микрообъеме биопленки примерно 200 на 200 на 40 кубических микрометров. Здесь приведены типичные результаты.

Значения J нуля, упругой податливости задаются как функция оси Z по глубине и оси y вдоль бокового размера биопленки. Каждая точка соответствует шву, для которого анализ кривой ползучести дал нулевое значение J. Данные показывают, что местная податливость варьируется по глубине биопленки почти на три порядка.

Кроме того, сильная латеральная гетерогенность имела место на всех высотах биопленки. Данные также обеспечивают распределение значений соответствия, которые демонстрируют широко распространенную и асимметричную форму. Сравнение этих результатов с результатами, полученными ранее на других биологических полимерах, позволяет предположить, что механические свойства биопленки поддерживаются сильно сшитыми полимерными гелями.

В двух измерениях биопленки были также продемонстрированы локальные свойства при различных условиях окружающей среды, таких как более низкая скорость потока, как можно увидеть здесь. Значения податливости биопленки, выращенной со скоростью 0,1 миллилитра в час, по-прежнему демонстрируют крайне неоднородный механический профиль. Но четкая Z-зависимость глубины жесткости биопленки, наблюдаемая в биопленке, выращенной со скоростью один миллилитр в час, исчезла.

Эти результаты демонстрируют существенное влияние внешних условий на организацию биопленки. Вы должны хорошо понимать, как картировать свойства Visco в Институте биопленки в условиях полностью контролируемого роста.