Сочетание 3D-привода магнитной силы и многофункциональной флуоресцентной визуализации для изучения метанобиологии ядра
5 июля 2022 г.
Это исследование представляет новый протокол для непосредственного применения механической силы на ядро клетки через магнитные микрошарики, доставляемые в цитоплазму, и для проведения одновременной флуоресцентной визуализации живых клеток.
В этом методе сила непосредственно прикладывается к ядру. Это отделяет эффект передачи силы от клеточной плазматической мембраны и цитоскелета, выявляя молекулярные механизмы ядерного механозондирования. Сила прикладывается внутри живых клеток неинвазивным способом.
По сравнению с оптическим пинцетом, магнитное поле и магнитная сила не влияют на функции ячейки и имеют более высокую пропускную способность. Начните культивирование клеток с помощью магнитных микрошариков, взвесив 0,2 грамма карбонильных железных микрогранул, имеющих семь микрометров среднего диаметра. Суспендировать микрогранулы в одном миллилитре RPMI 1640 с помощью пипетки.
Затем отнесите чашку Петри с B2B-клетками в шкаф биобезопасности и быстро добавьте в чашку Петри 200 микролитров среды, содержащей микрогранулы. Поместите чашку Петри в инкубатор до тех пор, пока микрошарики не усвоятся клетками. Откройте инвертированный микроскоп и, используя конфокальную флуоресцентную визуализацию, определите оптимальное время для интернализации клеточных линий каждые шесть часов, визуализируя микрогранулу, ядерную и клеточную границу.
Интернализованные микрошарики будут присутствовать в пределах границы клетки. Для применения малых усилий и визуализации живых клеток откройте программное приложение Elements. Чтобы определить конфигурацию магнитной находки, нажмите кнопку «один на два», чтобы установить скорость сканирования на один кадр в две секунды.
Установите размер точечного отверстия на 1.2 Airy unit. Проверьте только канал FITC и установите PMT HV как 70, смещение как ноль, интенсивность лазера как 10. Чтобы определить конфигурацию магнитного ядра YAP, установите скорость сканирования на один кадр в четыре секунды, нажав кнопку «один на четыре».
Затем нажмите кнопку 1.2 Airy unit, чтобы установить размер точечного отверстия на 1.2 Airy unit и проверьте канал FITC. Установите PMT HV как 70, смещение как ноль, интенсивность лазера как 10. Для визуализации границы ядра и интенсивности ядерного пятна проверьте канал цианина 5.
Не нажимайте кнопку устройства 1.2 Airy и установите PMT HV на 70, смещение до нуля и интенсивность лазера до 10. Размер точечного отверстия будет оптимизирован для трехмерной YES-ассоциированной визуализации белка. Затем включите DIA через Элементы.
Откройте спин-вид, используйте яркое поле и настройте фокус объекта, чтобы получить четкое изображение клеток в фокусе. Используйте объектив 10X, чтобы найти подходящие несколько одиночных клеток в трех условиях, таких как клетка с одной микрогранулой внутри, с несколькими микрошариками внутри и без какой-либо микрогранулы внутри. Затем переключитесь на цель 40X и назовите эту позицию соответствующим номером позиции.
Откройте Элементы, нажмите на магнитный поиск, снимите блокировку, затем сканируйте вкладки, затем выберите верхнюю и нижнюю кнопки, чтобы настроить положение Z фокальной плоскости для установки нижнего и верхнего предела для стека Z выбранных ячеек. Остановите сканирование, нажав кнопку Сканировать еще раз. Переключитесь на конфигурацию магнитного ядра YAP и задайте имя файла как before_small_force.nd2.
Нажмите на кнопку запуска с записанным стеком Z. Переключитесь на правый путь света и включите DIA. Откройте вращательный вид и нажмите кнопку записи.
Переместите магнит на 46 миллиметров над дном чашки Петри, вращая ручку движущегося устройства магнита. Сохраните и проверьте видео, чтобы подтвердить смещение микрошариков, вызванное магнитной силой. Повторите процедуру сканирования, установив имя файла как after_small_force.nd2.
Затем переключитесь на правый световой путь, включите DIA и откройте режим вращения, прежде чем нажать на кнопку записи. Покрутите ручку движущегося устройства магнита на высоте до 120 миллиметров над дном чашки Петри и сохраните последовательность изображений или видео с ярким полем. Повторите шаги сканирования, установив для имени файла значение before_large_force.nd2.
Микрошарики не могут излучать флуоресценцию при лазерном возбуждении в канале FITC или цианина 5. Таким образом, интернализованные микрошарики были идентифицированы по темной впадине, расположенной в конфокальной визуализации флуоресценции YES-ассоциированного белка и ядра. Ядерная цикличность не показала существенной разницы между контрольными клетками и клетками с интернализацией микрогранул.
YES-ассоциированное отношение ядра белковой клетки к цитоплазме контрольных клеток, культивируемых совместно с микрогранулой, но без интернализации, и клеток с интернализацией микрошарики также не показало существенной разницы. Деформация ядра и деполимеризация актина были вызваны силой сжатия, приложенной микрошариками в клетках, содержащих цитоскелет. Калибровочная кривая количественного анализа изображений, обеспечиваемая количественной зависимостью смещения силы AFM.
Исходя из этой взаимосвязи, была оценена приложенная сила бусин. Деформация ядра и YES-ассоциированная транслокация белка наблюдались при приложении или высвобождении магнитной силы. Изменения интенсивности YES-ассоциированного белка в зеленом канале и отсутствие изменений в окрашивании ядра в красном канале подтвердили, что вызванная магнитной силой ядерная деформация вызвана транслокацией белка, связанного с YES.
Количественная оценка чистого изменения отношения ядра и цитоплазмы к цитоплазме, связанного с YES, подтвердила, что магнитная сила, приложенная к микрошарикам в цитоплазме, индуцировала транслокацию белка, связанную с YES, и изменила отношение ядра белка к цитоплазме, связанного с YES. Прежде чем прикладывать силу и визуализировать, убедитесь, что клетки усвоили магнитные микрошарики, а бусины находятся в пределах клеточной границы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании рассматривается новый протокол прямого приложения механической силы к ядру клетки с помощью магнитных микросфер внутри живых клеток, что позволяет проводить флуоресцентную визуализацию живых клеток. Этот метод дает представление о механизмах ядерной механосенсорики, функционируя без нарушения клеточных процессов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Механобиология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Понимание механизмов ядерной механосенсорики имеет решающее значение для функционирования клеток.
- Существующие методы, такие как оптические пинцеты, являются инвазивными и менее эффективными.
- Магнитные микросферы предлагают неинвазивный способ изучения этих механизмов.
Используемые методы
- Приложение механической силы с использованием магнитных микробусин.
- Визуализация живых клеток с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.
- Количественный анализ изображений для измерения вызванной силой деформации ядра.
Основные результаты
- Приложение силы с помощью микросфер привело к деформации ядра и транслокации белка YES-associated protein.
- Значимых различий в округлости ядер между контрольными клетками и клетками с интернализацией микросфер не обнаружено.
- Исследование подтверждает, что магнитная сила влияет на пути ядерной механотрансдукции.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание механизмов ядерного механосенсинга.
- Он предлагает неинвазивный подход к исследованию клеточной механики и сигнальных путей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Прямое механическое воздействие на клеточное ядро с помощью трехмерных актуаторов магнитной силы и флуоресцентной визуализации живых клеток позволяет проводить точный неинвазивный анализ ядерной механотрансдукции. Данный подход восполняет критический пробел в понимании того, как механика ядра влияет на клеточную сигнализацию, что повышает прогностическую уверенность на этапах раннего поиска и валидации мишеней. Количественные показатели и считывание данных в режиме реального времени делают этот метод стратегическим инструментом для снижения механистических рисков и приоритизации портфеля проектов в биофармацевтических исследованиях и разработках.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую проверять гипотезы о ядерном механосенсинге независимо от влияния мембраны и цитоскелета.
- Обеспечивает функциональную валидацию путей механотрансдукции путем количественного анализа динамики YAP-белка (YES-associated protein) в ответ на контролируемую деформацию ядра.
- Снижает неопределенность механизмов путем изоляции вклада ядра в клеточную сигнализацию, что помогает в выборе и приоритизации терапевтических мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает подготовку валидированных систем с живыми клетками для последующих анализов в области механобиологии.
- Позволяет получать воспроизводимые количественные результаты визуализации для оценки транслокации YAP и показателей ядерной деформации.
- Обеспечивает стандартизацию параметров приложения силы и визуализации, что способствует масштабируемости анализа и повторному использованию платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует принципам механобиологии заболеваний путем моделирования реакций ядра на механический стресс в инженерных клеточных линиях.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя количественные биомаркеры ядерной механотрансдукции.
- Снижает трансляционные риски, уточняя роль механики ядра в функционировании клеток и патологии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность прямой количественной оценки ядерной механотрансдукции, что способствует как проведению исследований на основе гипотез, так и разработке аналитических методов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о ядерной механосенсорике и уточнение сигнальных путей путем разграничения ядерных и цитоплазматических эффектов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для сравнительного анализа механочувствительных ответов.
- Аналитика: позволяет проводить количественные измерения деформации ядра и транслокации YAP для надежного статистического анализа.
- Трансляционные исследования: дает понимание механизмов, актуальных для моделей заболеваний, при которых задействована механика ядра.
- Повторное использование в организации: создает универсальную платформу для исследований в области механобиологии на различных типах клеток и при разных экспериментальных условиях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет изоляции механизмов ядерной механотрансдукции.
- Практическая ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость анализов в области механобиологии.
- Стратегическая ценность: обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах благодаря количественным показателям в режиме реального времени.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение механосенситивных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области визуализации живых клеток, применения магнитных сил и количественного анализа изображений.
- Необходим доступ к конфокальной флуоресцентной микроскопии и оборудованию с магнитными актуаторами.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов калибровки силы и визуализации.
- Может потребоваться адаптация для различных типов клеток или механочувствительных путей.
- Пропускная способность и диапазон сил ограничены эффективностью интернализации микросфер и скоростью визуализации.
