Микроволновая печь-помощь Функционализация поли (этиленгликоль) и On-смолы пептиды для использования в цепных полимеризации и гидрогеля формирования

Общая цель этой процедуры заключается в функционализации полиэтиленгликоля и пептидов с метакрилатными группами для последующей цепной полимеризации и синтеза гидрогеля. Это достигается путем объединения метамфетаминового акрилового ангидрида и функционализированного прекурсора ООН в сцинтилляционном флаконе. Второй шаг заключается в использовании микроволновой энергии для функционализации пега или пептида.

Далее ПЭГ ДМ растворяют в хлорметане, либо пептид отделяют от смолы. А все защитные группы боковой цепи удаляются в коктейле на кислотной основе. Последним этапом является осаждение ПЭГ ДМ или функционализированного пептида метамфетамида в эфир.

В конечном счете, протонная ЯМР или времяпролетная масс-спектрометрия Мальди используется для демонстрации успешной функционализации пегового или пептидного макроса. Здравствуйте, меня зовут Эми Ван Хоув. Я учусь в аспирантуре на кафедре биомедицинской инженерии в Университете Рочестера.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами вроде реакции ПЭГ с фторидом метамфетамина заключается в том, что реакция протекает значительно быстрее и экологичнее. Здравствуйте, меня зовут Брэндон Уилсон. Я учусь на бакалавре в области химической инженерии в Университете Рочестера.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, например, как гидрогели могут быть использованы с использованием диметила PEG для контроля доставки терапевтических клеток в молекулах. Здравствуйте, меня зовут Даниэль Бенуа, я доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Рочестера. Применение этого метода заключается в разработке методов лечения различных заболеваний, поскольку синтезированные соединения могут быть использованы для доставки клеток и лекарств.

Перед началом этой процедуры пред высушил необходимую стеклянную посуду в духовке в течение одного часа, чтобы предотвратить загрязнение водой в большой сывороточной лодке. Выведите пять граммов колышка с молекулярной массой от 1000 до 100 000 дальтон. Если он присутствует, снимите пластиковый кусок с крышки сцинтилляционного флакона в химическом колпаке.

Выдайте 10 моляров метамфетаминового акрилового ангидрида в разорванный сцинтилляционный флакон. Затем добавьте в флакон ПЭГ. Затем неплотно закрутите крышку на флакон и поставьте флакон в микроволновую печь.

Установите микроволновую печь на пять минут на максимальную мощность в термостойких перчатках. Вынимайте флакон из микроволновой печи каждые 30 секунд. Затем полностью затяните колпачок и закрутите образец на 30 секунд.

Ослабьте крышку, прежде чем вернуть флакон в микроволновую печь. Повторяйте эти действия, пока раствор не будет разогреваться в микроволновой печи в течение полных пяти минут. Вынув флакон из микроволновой печи, ослабьте крышку и дайте PEG DM остыть до комнатной температуры.

Затем растворите ПЭГ DM в 10-15 миллилитрах дихлорметана. Осадите ПЭГ ДМ в 10-кратном избытке предатилового эфира в течение 20 минут. С помощью семисантиметровой воронки Бакнера и колбы на 500 миллилитров.

Соберите PEG DM с помощью вакуумной фильтрации. Далее переложите отфильтрованный ПЭГ ДМ в коническую трубку объемом 50 миллилитров с иглой большого калибра, продетой через колпачок для вентиляции. Поместите пробирку в вакуумную камеру и высушите PEG DM в течение ночи.

После извлечения трубки из вакуумной камеры красным цветом растворяют ПЭГ ДМ в осадке хлорметана DI с ледяным эфиром датила. Чтобы удалить нереактивный метамфетаминовый акриловый ангидрид после фильтрации и сбора, высушите PEG DM в вакуумной камере таким же образом, как и раньше. Для протонного ЯМР-анализа поместите примерно 10 миллиграммов ПЭГ ДМ в сцинтилляционный флакон и добавьте примерно один миллилитр дейтерированного хлороформа.

Как только образец растворится, переложите его в чистую ЯМР-пробирку. Затем соберите протонные ЯМР-спектры и запустите образцы при комнатной температуре в течение не менее 64 сканирований, чтобы получить достаточное разрешение данных. После синтеза интересующего пептида методом твердофазного синтеза храните его на смоле в ДМФА при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока он не будет готов к использованию.

Затем соберите пептидную смолу с помощью фильтрации с помощью семисантиметровой воронки Бакнера с фильтровальной бумагой и колбы объемом 250 миллилитров. Снимите пластиковый кусок с крышки сцинтилляционного флакона и переложите смолу во флакон. С помощью одноразовой пипетки добавьте ровно столько метамфетамина, сколько акрилового ангидрида, чтобы покрыть смолу Неплотно закрутив крышку на флакон, поместите его в микроволновую печь и установите таймер на три минуты.

На максимальной мощности надев термостойкие перчатки, вынимайте флакон из микроволновой печи каждые 15 – 20 секунд. После полного затягивания колпачка ввергните образец в течение 15 секунд. Ослабьте крышку, прежде чем вернуть флакон в микроволновую печь.

Повторяйте их, пока раствор не будет разогреваться в микроволновой печи в течение полных трех минут. Ослабив крышку флакона, дайте пептидному раствору остыть до комнатной температуры, используя небольшое количество DMF и семисантиметровую воронку бакнера. С фильтровальной бумагой и колбой на 250 миллилитров.

Соберите пептидную смолу из флакона для расщепления и глубокой защиты. Переложите пептидную смолу в свежий сцинтилляционный флакон на 0,25 ммоль аргининсодержащего пептида. Добавьте по 0,25 миллилитров пропилена, три, шесть диоксидов, один диол тиол с восьмиоктановым числом, деионизированную воду и 18,0 миллилитров ТЖК.

Затем вращайте реакционную смесь на лабораторном вращателе для землетрясения в течение четырех часов при комнатной температуре. Когда закончите, осадите пептид в 10-кратном избытке этилового эфира перед охлаждением. Равномерно распределите раствор между четырьмя 50-миллилитровыми коническими пробирками, центрифугируйте четыре образца при 3200 G в течение 10 минут для сбора пептида после центрифугирования, сцедите эфир, ресуспендируйте пептид в 100 миллилитрах свежего этилового эфира, разделенном между двумя 50-миллилитровыми коническими пробирками.

Повторите процесс центрифугирования. Восстановите, суспендируя пептид в 50 миллилитрах свежего эфира дважды, в общей сложности четыре промывки эфиром, после последнего этапа центрифугирования сцедите отработанный эфир и высушите пептид в течение ночи под вакуумом. Чтобы подготовить образец для времяпролетного анализа Maldi, поместите один-два миллиграмма пептида в пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитра и растворите образец в одном миллилитре растворителя Maldi.

После этого приготовьте матричный раствор из четырех гидроксикерамических кислот Alpha Sano в мульти-растворителе с концентрацией 10 мг на миллилитр. Объедините пептидный и матричный растворы в соотношении один к одному, разместите один микролитр объединенного раствора в трех отдельных местах на планшете с образцом MALDI. Высушите пятна с помощью теплового пистолета.

Затем повторно проточечно и высушите каждый образец. Наконец, соберите данные о времени полета MALDI и подтвердите увеличение молекулярной массы на 68 граммов на моль из-за добавления акриламидной группы метамфетамина к конечному концу пептида. Здесь показан ЯМР-спектр линейного ПЭГ DM в две килодальтонны, функционализированный с использованием микроволнового метода для этой реакции.

Протонный ЯМР-анализ может быть использован для расчета процентной функционализации от наблюдаемого к теоретическому отношению концевых метакрилатных протонов к центральным протонам ПЭГ. Общий процент функционализации составляет 91%, и этот PEG DM адекватно функционализирован для использования в синтезе гидрогеля. Смотрите текстовый протокол для получения подробной информации о вычислении процентной функционализации из-за множества протонных пиков, возникающих при протонном ЯМР-анализе пептидов PEP.

Функционализацию пептидов легче исследовать с помощью времяпролетной масс-спектрометрии maldi. Это продемонстрировано здесь, где пептид G-K-R-G-D-S-G был синтезирован и подвергнут функционализации акриламида метамфетамином, небольшая часть пептида была расщеплена для предварительной оценки молекулярной массы, которая показала наблюдаемый пик молекулярной массы, приходящийся на уровне 676 граммов на моль, ожидаемую молекулярную массу пептида, оставшаяся часть пептида подверглась функционализации акриламида метамфетамина до расщепления после функционализации акриламида метамфетамина. Наблюдаемый пик молекулярной массы приходится на 744 грамма на моль, что является ожидаемой массой функционализированного пептида метамфетамина

Чтобы продемонстрировать функциональность как PEG DM, так и функционализированных пептидов метамфетамида, гидрогели PEG были изготовлены с 0,5 миллимолярного метамфетамина и без него. Показанный здесь акриламид функционализированный GK R-G-D-S-G представляет собой репрезентативные фазовый контраст и живые мертвые флуоресцентные изображения МСК только на пег-гелях и на пег-гелях, содержащих функционализированный метамфетаминовый пептид. МСК не смогли прилипнуть к функционализированным ООН пег-гидрогелям, но при включении пептида адгезии клеток RGD они смогли адгезиваться и распространяться по поверхности гидрогеля.

Изображения живых мертвецов не отражают жизнеспособность популяции засеянных MSC. Скорее, флуоресцентные изображения предназначены для разграничения между адгезивными клетками и небольшими вариациями в топологии гидрогеля, что может быть затруднительно при использовании только фазового контраста. Интересно, что нераспространенные клетки, посеянные только на ПЭГ, имеют положительное окрашивание как на кальций AM, так и на гомодимер AUM, что указывает на то, что клетки умирали во время визуализации.

Одним из многих преимуществ гидрогелей ПЭГ является их высокая настраиваемость, изменяющая конкретный состав ПЭГ. Гидрогель обеспечивает исследователям высокую степень контроля над такими свойствами, как модуль упругости, как показано здесь. Известно, что как молекулярная масса ПЭГ, так и массовый процент контролируют размер гидрогелевой сетки, результирующий гидрогель, жесткость и скорость высвобождения инкапсулированных препаратов.

Это было продемонстрировано путем получения гидрогелей с различной молекулярной массой PEG dm и исследования результирующего модуля гидрогеля и размера ячеек при гипотетическом увеличении молекулярной массы ПЭГ. Macer вызвал увеличение размера гидрогелевой сетки и снижение жесткости гидрогеля, размер гидрогелевой сетки и результирующую жесткость геля также можно контролировать, изменяя вес. Процентное содержание гидрогелей ПЭГ было получено с различной массой.

Процент линейного 10 килодальтонного PEG DM и жесткость гидрогеля и размер ячеек были определены, как показано здесь, увеличение весового процента PEG вызывает значительное уменьшение размера ячеек и увеличение жесткости гидрогеля. Гидрогели, содержащие инкапсулированный бычий сывороточный альбумин, получали с использованием пега с различной молекулярной массой, как показано здесь. Высвобождение сывороточного альбумина крупного рогатого скота происходит быстрее из гидрогелей, образованных с использованием PEG DM с более высокой молекулярной массой, в результате большего размера ячеек внутри гидрогеля.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как синтезировать ПЭГ ДМЭ с помощью микроволнового метода и как оценить функционализацию с помощью протонного ЯМР. Освоив эту процедуру, можно также использовать открытие кольца гидролитически разлагаемых групп, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как деградация гидрогеля влияет на функцию клетки. Вы также должны хорошо понимать, как этот метод может быть использован для избирательного включения функциональности акриламида метамфетамина в последовательности пептидов на конечных концах и как оценить эту функционализацию с помощью многовременной масс-спектрометрии.

Спасибо за просмотр.